В обзоре представлены примеры использования проточной цитометрии и сортинга в биотехнологическом производстве для оптимизации и контроля за быстрыми морфологическими изменениями и внутренним состоянием клеток в реальном времени в биореакторах.
Проточная цитометрия — это метод, основанный на регистрации оптических параметров частиц, находящихся в потоке, по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Проточная цитометрия имеет широкий спектр применения. Используется в науке, медицине, фармацевтической индустрии, сельском хозяйстве (животноводство, молочная промышленность, растениеводство, виноделие, пивоварение и агрономия) которое фокусируется на селекции и формировании гибридных форм. В 2020 - 2021 году проточные цитометры – одно из самых продаваемых оборудований в области клеточной / молекулярной биологии.
Проточная цитометрия занимает особое место в биотехнологическом производстве, поскольку является незаменимым инструментом для быстрого анализа всех промежуточных этапов до получения финального продукта. В биореакторах проточной цитметрией отслеживается состояние клеток, которое зависит в первую очередь от: генетических, физико-химических факторов. В процессе изменения параметров (pH, механические воздействия, голодание по питательным веществам, например в процессе ферментации) в биореакторах появляется большое количество внеклеточных везикул (эктосомы, экзосомы, апоптозные тельца, и т.д.) и клеточных метаболитов разных типов – из-за этого мониторинг биопроизводства является сложным процессом.
Любой этап работы с культурами клеток может быть проверен и проконтролирован с помощью проточной цитометрии.
С помощью проточной цитометрии создается база данных по клеточной морфологии – это поможет в долгосрочном мониторинге в биопроизводстве и оптимизации процессов.
Некоторые варианты использования проточной цитометрии в биопроизводстве описаны далее.
Внеклеточные везикулы (ВВ) действуют как многофункциональные сигнальные комплексы, так как они участвуют в контроле скоординированных процессов, важных для общего гомеостаза клеток и клеточных популяций. Высвобождение внеклеточных везикул в культуральную среду зависит от состояния клеток (апоптоза, некроза, пролиферации, аутофагии, фероптоза и т.д.).
Умирающие клетки выделяют большое количество везикул (Рисунок 1), концентрация внеклеточных везикул может быть использована в качестве параметра, который отражает условия в биореакторах и даёт информацию о текущем состоянии биопроцесса. Если концентрация внеклеточных везикул увеличивается это свидетельствует о том, что условия в биореакторах ухудшились, это последствие апоптоза или ускоренной пролиферации клеток.
Жизнеспособность клеток в биореакторах можно определить по стандартной методике: окрашивание пробы пропидий иодидом и исследованием на проточном цитометре. На большинстве проточных цитометров сбор и анализ данных по внеклеточным везикулами выполнены с помощью лазера с длиной волны 488 нм (200 мВт мощности) и стандартным набором оптических фильтров.
Определение концентрации внеклеточных везикул проводится на трех типах образцов.
1. Образцы из ферментационного бульона без обработки (Рисунок 2).
2. Супернатант клеточной культуры после того, как клетки были удалены центрифугированием.
3. Образцы изолированных и концентрированных внеклеточных везикул.
Рисунок 1. Повышение концентраций внеклеточных везикул (ВВ) в ходе культивирования клеток в биореакторе с исследованием выделенных внеклеточных везикул проточным цитометром.
Рисунок 2. Измерение необработанных образцов из ферментационного бульона. Показаны репрезентативные графики прямого светорассеяния (FS) и бокового светорассеяния: (SS) клетки (cells), EVs (внеклеточные везикулы).
Микроводоросли представляют собой разнообразную группу микроорганизмов, различающуюся по морфологии, экологии, физиологии, биохимии. Микроводоросли встречаются в пресноводных и морских экосистемах и существуют индивидуально, цепочками или группами. Микроводоросли применяются как сырье нового поколения в области фармацевтики, производства биотоплива и продуктов питания. Контаминация культуры микроводоросли, вызванная паразитами, является проблемой, снижающей продуктивность на биоперерабатывающих заводах, и ведет к экономическим потерям. С помощью проточной цитометрии микроводоросли можно отличить от прокариотических организмов (паразитов микроводорослей) по размеру и зернистости, то есть по интенсивности прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния (Рисунок 3). Проточная цитометрия позволяет оптимизировать биопроцессы, связанные как с биомассой микроводорослей, так и с производством синтезируемых соединений. Еще одни вариант использования проточной цитометрии – отслеживание динамики паразитов микроводорослей.
Рисунок 3. График плотоности (dual-density-plots) в зеленом (FL1, (533нм)) и красном (FL3,(670нм) флуоресцентном канале. Гейтированые области, включают водоросли, HNAp, LNAp, и HFL3p, которые показаны на А) axenic Tistrella sp., Б) axenic Sphingpyxis sp., В) Tistrella sp.– C. vulgaris - сокультивирование, Г) Sphingopyxis sp.– C. vulgaris - сокультивирование Sphingpyxis sp., Tistrella sp., Pseudomonas sp.– C. vulgaris сокультивирование и засеяны на более низкой и (Д) и более высокой (Е) начальной концентрацией прокариот (паразитов) чем C. Vulgaris.
Оборудование, использованное в эксперименте по улучшению управления экосистемой микроводорослей in situ.
1. Шейкер-инкубатор, Multitron, Infors.
2. Проточный цитофлуориметр, Guava easyCyte, Luminex.
В биореакторах проходит темное брожение (Dark Fermentation) которое сопровождается большим разнообразием в основном ферментативных бактерий (например, свободные споры, палочковидные бактерии и эндоспоры, которые являются типичными для Clostridium spp.). Анализ культуры проточным цитометром, вместе с микроскопическим наблюдением позволил в ходе ферментации в темноте отслеживать преобладающие по морфологии бактерии. Использование флуоресцентного красителя DiBAC4 (Bis(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) в измерениях проточным цитометром давало информацию о физиологическом состоянии бактерий при ферментации в разных фазах культивирования (Рисунок 4).
Оборудование использованное в эксперименте по мониторингу физиологического состояния кукурузы/травяного силоса при темном брожении.
1. Биореактор Techfors, Infors (50-100 л).
2. Проточный цитофлуориметр, до 5 лазеров, до 27 флуоресцентных каналов, ZE5, Bio-Rad.
Рисунок 4. Анализ культуры проточным цитометром, с микроскопическим наблюдением, для отслеживания преобладающих по морфологии бактерии.
В пищевой промышленности бактерии используются в качестве заквасок при производстве пищевых продуктов, таких как йогурт, сыр, кефир, вино. Некоторые кисломолочные бактерии, такие как Lactobacillus acidophilus, употребляются как пробиотик для баланса микрофлоры в желудочно-кишечном тракте. В связи с возрастающей конкуренцией среди производителей, важно сделать промышленный процесс производства пробиотиков эффективным и надежным. Проточная цитометрия дает более глубокое представление о процессе производства, описывая не только морфологию бактерий в любой момент времени, но и количество жизнеспособных бактерий. Результаты исследования методом проточной цитометрии свидетельствуют о том, что можно обнаружить такие изменения в процессе роста бактерий, которые в противном случае могли бы остаться незамеченными.
Оборудование, использованное в эксперименте по исследованию бактерий как потенциальных инструментов для мониторинга процессов в промышленной биотехнологии.
1. Биореактор (ферментер) Techfors-S, Infors
2. Проточный цитофлуориметр, Amnis ImageStreamX Mark II, Luminex
Определению абсолютного количества бактерий в активном иле уделяется мало внимания. Получение информации о структуре, функции бактерий и их ответ на окружающую среду в актовном иле является необходимой для водных экосистем.
Проточная цитометрия это быстрый, лёгковоспроизводимый и экономичный метод для решения определения общего количества бактерий и концентрации биомассы в активном иле, по сравнению с другими утомительными, трудоёмкими методами. Измерение общего объёма бактерий проточной цитометрией в сочетании с секвенированием, позволит изучить биоразнообразие, филогению и систематику, физиологию, экологию и эксплуатацию в биопроизводстве.
Проточная цитометрия — это незаменимый инструмент для улучшения оптимизации биопроцессов (в биореакторах). Проточная цитометрия позволяет контролировать быстрые морфологические изменения и оценивать внутреннее состояние клеток в реальном времени.
1) Extracellular vesicles concentration is a promising and important parameter for industrial bioprocess monitoring. Biotechnol J. 2016 May;11(5):603-9. doi: 10.1002/biot.201500049. Epub 2016 Feb 12.
2) Automated Online Flow Cytometry Advances Microalgal Ecosystem Management as in situ, High-Temporal Resolution Monitoring Tool. Front Bioeng Biotechnol. 2021 Mar 23;9:642671. doi: 10.3389/fbioe.2021.642671. eCollection 2021.
3) Monitoring the Physiological State in the Dark Fermentation of Maize/Grass Silage Using Flow Cytometry and Electrooptic Polarizability Measurements. Carlos E. Gómez-Camacho, Klaus Pellicer Alborch, Anika Bockisch, Peter Neubauer, Stefan Junne & Bernardo Ruggeri. BioEnergy Research volume 14, pages 910–923 (2021).
4) Bacterial Flow Cytometry and Imaging as Potential Process Monitoring Tools for Industrial Biotechnology. Sumana Kadamalakunte Narayana, Sanjaya Mallick, Henrik Siegumfeldt and Frans van den Berg Fermentation 2020, 6, 10; doi:10.3390/fermentation6010010.
5) A flow cytometry method for bacterial quantification and biomass estimates in activated sludge. M.R. BrownC.L. HandsT. Coello-GarciaB.S. SaniA.I.G. OttS.J. SmithR.J. Davenport. Journal of Microbiological Methods. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2019.03.022. Volume 160, May 2019, pages 73-83.
0500-3115
|
|
|
20 151 704
20 151 704 AMD
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Muse — компактный клеточный анализатор, работающий по принципу проточной цитометрии для простого и недорого и быстрого анализа. Управление через сенсорный дисплей, интуитивное программное обеспечение, оптимизированные наборы реагентов формата «смешать и измерить» вместе обеспечивают существенное упрощение решения исследовательских задач.
Клеточный анализатор Muse обеспечивает прямое измерение концентрации клеток (без использования референсных частиц) и количественную детекцию флуоресцентных параметров. Оптимизированные наборы реагентов и адаптированные к ним модули программного обеспечения позволяют определять жизнеспособность клеток, апоптоз на разных этапах, исследовать пролиферацию и клеточный цикл, клеточный сигналинг, параметры иммунного статуса и др.
Преимущества системы:
Технические характеристики:
Проточный цитофлуориметр Muse, видеообзор, Luminex, 2019
Быстрая детекция каспазной активности в клетках, Muse, Luminex, брошюра, англ. яз., 2 стр.pdf
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
0500-4012
|
|
|
По запросу По запросу |
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Особенность всех проточных цитофлуориметров серии Guava easyCyte – проточная ячейка на основе запатентованной микрокапиллярной технологии. Использование микрокапиллярных взаимодействий для выравнивания клеток в потоке позволило отказаться от обжимающей жидкости и снизить количество отходов (до 50 мл за 8 часов работы). Технические характеристики:
Конфигурации Guava EasyCyte:
Сбор данных на проточном цитометре Guava easyCyte, видео, Luminex, 2019 Проточные цитометры Guava easyCyte, Luminex, брошюра, англ. яз.,16 стр.pdf Технические характеристики Guava easyCyte, Luminex, англ. яз., 3 стр.pdf См. также: Заказ антител Abcam |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100370
|
|
|
По запросу По запросу |
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Проточная цитометрия с функцией визуализации в потоке — это новое направление, сочетающее в себе не только возможности математического и статистического анализа клеток, но и микроскопию высокого разрешения каждой анализируемой клетки в потоке.
Системы ImageStreamX MKII и FlowSight обеспечивают анализ большого количества изображений каждой клетки в потоке, включая светлопольный и темнопольный каналы (SSC) и до 10 флуоресцентных каналов на высокой скорости. Комбинирование скорости, чувствительности и фенотипических возможностей проточной цитометрии с одной стороны и детализации изображений и функциональных возможностей микроскопии с другой стороны, позволяют визуализирующим проточным цитометрам ImageStream и FlowSight обойти ограничения обоих методов и открывают двери для широкого спектра новых приложений. Цитометры FlowSight и ImageStreamX функционируют как обычные проточные цитометры, но также обеспечивают анализ изображений каждой клетки. Мощное и интуитивно понятное программное обеспечение позволяет беспрепятственно связывать количественные данные с изображениями:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
100220
|
|
|
По запросу По запросу |
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Проточная цитометрия с функцией визуализации в потоке — это новое направление, сочетающее в себе не только возможности математического и статистического анализа клеток, но и микроскопию высокого разрешения каждой анализируемой клетки в потоке.
Системы ImageStreamX MKII и FlowSight обеспечивают анализ большого количества изображений каждой клетки в потоке, включая светлопольный и темнопольный каналы (SSC) и до 10 флуоресцентных каналов на высокой скорости. Комбинирование скорости, чувствительности и фенотипических возможностей проточной цитометрии с одной стороны и детализации изображений и функциональных возможностей микроскопии с другой стороны, позволяют визуализирующим проточным цитометрам ImageStream и FlowSight обойти ограничения обоих методов и открывают двери для широкого спектра новых приложений. Цитометры FlowSight и ImageStreamX функционируют как обычные проточные цитометры, но также обеспечивают анализ изображений каждой клетки. Мощное и интуитивно понятное программное обеспечение позволяет беспрепятственно связывать количественные данные с изображениями:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CS-100196
|
|
|
По запросу По запросу |
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Проточный цитометр CellStream, Luminex — компактная система, обладающая высокой чувствительностью и гибкостью для мультипараметрического анализа клеток и субмикронных частиц:
В отличие от традиционных систем на базе PMT, проточный цитометр CellStream регистрирует изображения, что дает возможность анализировать морфологические параметры и обеспечивает визуализацию всех событий, а следовательно, и простую верификацию выделения популяций, отделения одиночных событий от агрегатов и т.д. Уникальные возможности CellStream:
Технические характеристики:
¹ FSC, forward scatter — прямое светорассеивание. ² SSC, side scatter — боковое светорассеивание. ³ MESF, molecules of equivalent soluble fluorochrome — число молекул эквивалентного растворимого флуорохрома. Проточный цитометр Amnis CellStream, видеообзор, Luminex, 2019 16-цветное иммуннофенотипирование главных субпопуляций лимфоцитов и миелоидных клеток в мононуклеарной фракции и цельной крови с помощью проточного цитометра Amnis CellStream, постер, англ.яз., 1 стр.pdf Проточный цитометр Amnis CellStream, Luminex, брошюра, англ.яз., 7 стр.pdf Иммуннофенотипирование экстрацеллюлярных везикул с помощью проточного цитометра Amnis CellStream, брошюра, англ.яз., 4 стр.pdf. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A31266_comp
|
|
|
По запросу По запросу |
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Уникальная особенность Attune NxT — функция акустической фокусировки, позволяющей проводить измерения с высокой скоростью без потери качества, сохраняя низкую вариабельность.
Возможности Attune NXT при анализе плоидности:
Технические характеристики:
¹ forward scatter, прямое светорассеивание; ² side scatter, боковое светорассеивание; ³ molecules of equivalent soluble fluorochrome, число молекул эквивалентного растворимого флуорохрома. Проточный цитометр Attune NxT, Thermo FS, брошюра, русск., 36 стр. Технические характеристики Attune Nxt, Thermo FS, брошюра, англ., 8 стр. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
A24858
|
|
|
По запросу По запросу |
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Уникальная особенность Attune NxT — функция акустической фокусировки, позволяющей проводить измерения с высокой скоростью без потери качества, сохраняя низкую вариабельность.
Возможности технологии акустической фокусировки:
Технические характеристики:
¹ forward scatter, прямое светорассеивание; ² side scatter, боковое светорассеивание; ³ molecules of equivalent soluble fluorochrome, число молекул эквивалентного растворимого флуорохрома. Проточный цитометр Attune NxT, Thermo FS, брошюра, русск., 36 стр. Технические характеристики Attune Nxt, Thermo FS, брошюра, англ., 8 стр. См. также: Заказ антител Abcam. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bigfoot
|
|
|
По запросу По запросу |
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermo FS
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
P3566
|
|
10 мл
|
хранение +2...+8 в темноте, транспортировка комнатная температура
|
253 272
253 272 AMD
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Красный флюоресцентный краситель, окрашивает ядро и хромосомы, так как не проникает в живые клетки, используется для окрашивания мёртвых клеток в популяции. Применяется для флюоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии, проточной цитометрии и флюорометрии.
Длина волны возбуждения флуоресценции, нм — 535. Длина волны испускания флуоресценции, нм — 617. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermo FS
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
P21493
|
|
100 мг
|
298 036
298 036 AMD
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Красный флюоресцентный краситель, окрашивает ядро и хромосомы, так как не проникает в живые клетки, используется для окрашивания мёртвых клеток в популяции. Применяется для флюоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии, проточной цитометрии и флюорометрии.
Длина волны возбуждения флуоресценции, нм — 535. Длина волны испускания флуоресценции, нм — 617. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermo FS
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
P1304MP
|
|
100 мг
|
233 354
233 354 AMD
|
|
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Красный флюоресцентный краситель, окрашивает ядро и хромосомы, так как не проникает в живые клетки, используется для окрашивания мёртвых клеток в популяции. Применяется для флюоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии, проточной цитометрии и флюорометрии.
Длина волны возбуждения флуоресценции, нм — 535. Длина волны испускания флуоресценции, нм — 617. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
См. также:
Аксессуары для проточных цитофлуориметров
Вам также может быть интересно:
Определение плоидности клеток растений методами проточной цитометрии
Проточный цитометр ZE5, Bio-Rad для фармацевтической промышленности – технологический прорыв!
С помощью личного кабинета Вы сможете: