Молекулярное клонирование, модификация нуклеиновых кислот

X-gal, или 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид — хромогенный субстрат для фермента бета-галактозидазы. При расщеплении бета-галактозидазой от субстрата отщепляется индольная структура, которая спонтанно окисляется и выпадает в виде осадка синего цвета. Это свойство широко используется в молекулярной и клеточной биологии.

В первую очередь, X-gal применяется для анализа активности репортерного гена lacZ, кодирующего бета-галактозидазу, в клетках бактерий, дрожжей и животных. В растениях в качестве репортерного гена, маркером активности которого также является X-gal, используется ген GUS.

Также X-gal используется совместно с конъюгатами гликозидаз в качестве реагента для вторичной детекции при иммуногистохимии и ELISA.

Наконец, поскольку бета-галактозидаза сохраняет свою активность в фиксированных клетках и тканях, X-gal используется для детекции её активности.

Деионизованная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) и отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для экспериментов с использованием РНК.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Не предназначена для ПЦР и экспериментов in vivo.

Деионизованная вода, отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для молекулярной биологии.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

ДНКаза I - эндонуклеаза, расщепляющая одно- и двухцепочечную ДНК. Она гидролизует фосфодиэфирные связи, что приводит к образованию олигодезоксинуклеотидов и монодезоксинуклеотидов с 5’-фосфатом и 3’-OH.

Так как фермент рекомбинантный, его раствор не содержит РНКаз.

Активность ДНКазы I зависит от присутствия ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, а также Mn²⁺. В присутствии Mg²⁺ фермент расщепляет каждую цепь двухцепочечной ДНК независимо друг от друга, случайным образом. В присутствии Mn²⁺ расщепление обеих цепей двухцепочечной ДНК происходит приблизительно в одном и том же месте, при этом концы фрагментов ДНК - тупые или выступающие на 1-2 нуклеотида.

Применение:

• Получение препаратов РНК, не содержащих примеси ДНК;
• расщепление матрицы ДНК после транскрипции in vitro;
• обратная транскрипция;
• мечение ДНК методом ник-трансляции (с использованием ДНК-полимеразы I);
• изучение взаимодействий «ДНК-белок» методом футпринтинга;
• получение библиотек вставок ДНК, перекрывающихся случайным образом.

Фермент комплектуется двумя 10-кратными реакционными буферами - с MgCl₂ и без MnCl₂

Важно! ДНКаза I чувствительна к физической денатурации - не перемешивать на вортексе или пипетированием. Перемешивать только переворачиванием пробирки.

Условия хранения: -20^оС

Ингибитор RiboLock ингибирует активность РНКаз А, В и С по неконкурентному механизму в соотношении 1 : 1. Не ингибирует эукариотические РНКазы T1, T2, U1, U2, CL3 и прокариотические РНКазы H и I.

Работает в большинстве реакционных смесей и защищает РНК от деградации при температурах до +55^оС.

Рекомендуемая рабочая концентрация - 1 ед/мкл.

В состав буфера для хранения входит ДТТ, который обеспечивает стабильность ингибитора, но не является необходимым компонентом реакционной смеси.

Области применения:

• Предохранение РНК от деградации при транскрипции и трансляции in vitro, обратной транскрипции, амплификации РНК, выделении мРНК-протеинового комплекса из клеток млекопитающих;
• выделение и хранение РНК;
• исследование специфической РНКазной активности.

Условия хранения: -20^оС

ИПТГ (Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид) - высокостабильный аналог лактозы. Он инактивирует lac-репрессор и индуцирует синтез бета-галактозидазы, фермента, метаболизирующего лактозу. Используется как индуктор экспрессии генов, клонированных под контроль lac-оперона.

Также используется совместно с X-Gal для бело-голубой селекции клонов.

Рекомендуется приготовление стокового раствора в концентрации 100 мМ. Для бело-голубой селекции используется конечная концентрация 0.1 мМ.

Условия хранения: +4^оС

Водный раствор хлорида магния, отфильтрованный через мембрану 0.22 мкм. Предназначен для оптимизации условий ПЦР. Совместим со всеми полимеразами Thermo Scientific -Taq, DreamTaq, Phusion и др. Также может использоваться в качестве ко-фактора в других ферментативных реакциях.

Не содержит эндо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Условия хранения: -20^оС

Современные ДНК-лигазы одинаково быстро и эффективно сшивают как липкие, так и тупые концы. Одна из таких разновидностей лигаз используется в готовых наборах для клонирования CloneJET PCR, Thermo Fisher Scientific.

Наборы CloneJET PCR – это оптимизированные системы с позитивной селекцией для эффективного клонирования ПЦР-продуктов, синтезированных любыми термостабильными ДНК-полимеразами. С помощью наборов CloneJET PCR можно клонировать ДНК-фрагменты с любыми концами – тупыми или липкими, фосфорилированными или не фосфорилированным. Лигирование занимает всего 5 минут, а выход рекомбинантных клонов составляет более 99% благодаря использованию вектора pJET1.2/blunt с позитивной системой селекции.

Примеры применения:

• клонирование продуктов ПЦР с тупым или 3'-dA-концом длиной до 10 кб;
• клонирование фрагментов ДНК, генерируемых рестрикционными ферментами;
• секвенирование клонированной ДНК;
• транскрипция in vitro и in vivo клонированных вставок из промотора T7.

Клонирование с использованием наборов CloneJET PCR включает в себя этап достройки липких концов, получающихся при использовании для ПЦР стандартной Taq-полимеразы или при рестриктазном расщеплении ДНК. При этом реакция лигирования тупоконечной вставки длиной до 3000 пар нуклеотидов с линейным вектором занимает всего 5 минут (при более длинных вставках время лигирования увеличивается). Позитивная селекция клонов со вставкой осуществляется за счёт встраивания клонируемого фрагмента в последовательность летального гена eco47IR, тем самым выключая этот ген и обеспечивая жизнеспособность рекомбинантных клонов.

Преимущества наборов CloneJET PCR:

• универсальный вариант для клонирования фрагментов с тупым или липким концами;
• быстрое клонирование ПЦР-фрагмента всего за 5 минут;
• эффективность – более 99% положительных клонов;
• отсутствие фоновых клонов с «пустым» вектором.

Стартовый комплект реагентов и рестриктаз Anza 10-pk включает в себя 5 эндонуклеаз рестрикции, 2 модифицирующих ДНК фермента и буферы.

Состав набора:

• Anza 11 EcoRI;
• Anza 5 BamHI;
• Anza 1 NotI;
• Anza 16 HindIII;
• Anza 12 XbaI;
• Anza 8 XhoI;
• Anza 3 BcuI (isoschizomer to SpeI);
• Anza 10 DpnI;
• Anza 19 BglII;
• Anza 26 Eco32I (isoschizomer to EcoRV);
• Anza T4 DNA Ligase Master Mix;
• Anza Alkaline Phosphatase;
• Anza Buffer (10X);
• Anza Red Buffer (10X).

Эндонуклеазы рестрикции, ДНК-модифицирующие ферменты и наборы ферментов для клонирования ДНК Anza, Thermo Fisher Scientific — это современные технологии, которые помогают экономить время и реагенты при постановке генно-инженерных экспериментов. Продукция Anza — это линейка ферментов, позволяющая исследователю использовать: 128 рестриктаз; 5 ДНК-модифицирующих ферментов. При клонировании с помощью ферментов Anza используется общий протокол для расщепления ДНК любыми рестриктазами Anza, а также единый буфер для рестриктаз и ДНК-модифицирующих ферментов. Такой подход устраняет необходимость в последовательных инкубациях и промежуточных очистках ДНК, необходимых при смене буферов, что позволяет существенно экономить время и снизить потери образца. Преимущества наборов ферментов для клонирования Anza (в состав наборов включены 5 или 10 наиболее часто используемых рестриктаз, ДНК-лигаза, щелочная фосфатаза и универсальный буфер): удобно: все ферменты Anza полноценно работают в универсальном буфере Anza; быстро: 15-минутный протокол обработки ДНК; просто: не требуются сложные и длительные этапы промежуточной очистки продуктов реакции; надежно: отсутствие "звездной" активности; полная система: в набор входят все необходимые модифицирующие ферменты ДНК Anza для полноценного клонирования.

Стартовый комплект реагентов и рестриктаз Anza 5-pk включает в себя 5 эндонуклеаз рестрикции, 2 модифицирующих ДНК фермента и буферы.

Состав набора:

• Anza 11 EcoRI;
• Anza 5 BamHI;
• Anza 1 NotI;
• Anza 16 HindIII;
• Anza 12 XbaI;
• Anza T4 DNA Ligase Master Mix;
• Anza Alkaline Phosphatase;
• Anza Buffer (10X);
• Anza Red Buffer (10X).

Эндонуклеазы рестрикции, ДНК-модифицирующие ферменты и наборы ферментов для клонирования ДНК Anza, Thermo Fisher Scientific — это современные технологии, которые помогают экономить время и реагенты при постановке генно-инженерных экспериментов. Продукция Anza — это линейка ферментов, позволяющая исследователю использовать: 128 рестриктаз; 5 ДНК-модифицирующих ферментов. При клонировании с помощью ферментов Anza используется общий протокол для расщепления ДНК любыми рестриктазами Anza, а также единый буфер для рестриктаз и ДНК-модифицирующих ферментов. Такой подход устраняет необходимость в последовательных инкубациях и промежуточных очистках ДНК, необходимых при смене буферов, что позволяет существенно экономить время и снизить потери образца. Преимущества наборов ферментов для клонирования Anza (в состав наборов включены 5 или 10 наиболее часто используемых рестриктаз, ДНК-лигаза, щелочная фосфатаза и универсальный буфер): удобно: все ферменты Anza полноценно работают в универсальном буфере Anza; быстро: 15-минутный протокол обработки ДНК; просто: не требуются сложные и длительные этапы промежуточной очистки продуктов реакции; надежно: отсутствие "звездной" активности; полная система: в набор входят все необходимые модифицирующие ферменты ДНК Anza для полноценного клонирования.

РНКаза А - эндорибонуклеаза, расщепляющая одноцепочечную РНК по цитозиновым и урациловым остаткам. Так как РНКаза А от Thermo Scientific не содержит ДНКаз, не требуется её термическая обработка перед использованием.

Области применения:

• Выделение плазмидной и геномной ДНК;
• удаление РНК из препаратов рекомбинантных белков;
• исследования защищённости от РНКаз (совместно с РНКазой Т);
• картирование 1-нуклеотидных мутаций в ДНК и РНК.

Рекомендуемая рабочая концентрация РНКазы А - от 1 до 100 мкг/мл. В присутствии NaCl в низких концетрациях (до 100 мМ) РНКаза А расщпляет 1- и 2-цепочечную РНК, а также цепь РНК в составе гибридов ДНК-РНК. В присутствии NaCl в концентрации 0.3М и выше РНКаза А расщепляет только 1-цепочечную РНК.

Условия хранения: -20^оС