Флуориметры (люминометры) — приборы для количественного определения веществ по интенсивности
флуоресценции. Флуоресценция является частным случаем
люминесценции — явления испускания света химическим веществом, находящимся в возбужденном состоянии, при переходе в основное состояние. Испускание света после его поглощения происходит через определенный промежуток времени, этот временной промежуток — длительность пребывания молекулы в возбужденном состоянии. В зависимости от времени жизни различают люминесценцию с быстро затухающим излучением —
флуоресценция, 10⁻⁹-10⁻⁶ c, и медленно затухающим излучением —
фосфоресценция, 10⁻³-10 c. Также люминесценция различается по методу возбуждения:
- фотолюминесценция (облучение ультрафиолетовым и видимым светом);
- хемилюминесценция (в результате химических реакций);
- электролюминесценция (при воздействии электрическим током);
- биолюминесценция (обусловлена специфическими ферментами) и др.
Способностью флуоресцировать обладают молекулы многих биологических веществ: нуклеиновых кислот, коферментов, витаминов, продуктов окисления, пигментов и т.д.
Флуоресценция органических соединений лежит в ультрафиолетовой (200-400 нм), видимой (400-760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра.
Флуориметрический метод (флуоресцентная спектрофотометрия) основан на возбуждении электронных спектров испускания молекул определяемого вещества при внешнем УФ-облучении при фиксированной длине волны возбуждающего облучения и измерении интенсивности излучаемого флуоресцентного света. Из-за частичной потери энергии при переходе молекулы из возбуждённого состояния в основное (стоксовы потери) длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света на 20-30 нм и более. Интенсивность флуоресценции пропорциональна количеству света, адсорбированного образцом. Таким образом, она прямо пропорциональна концентрации растворённого вещества и абсолютному значению начальной интенсивности света. При количественных определениях с использованием метода флуориметрии применяют калибровочные графики, построенные на основании флуориметрии эталонных растворов.
Флуориметрический анализ в относительно широкой области спектра проводят с помощью фильтрационных
флуориметров, которые в канале возбуждения и флуоресценции имеют простой светофильтр. Свет от источника попадает на первичный фильтр (фильтр возбуждения), где происходит отбор длин волн требуемого интервала и блокирование остальных длин волн. Затем выделенное излучение попадает на кювету с пробой и возбуждает в ней флуоресцентное излучение, которое проходит через вторичный фильтр (фильтр эмиссии), отсекающий рассеянный возбуждающий свет, а затем попадает на фотодетектор, где пропорционально преобразуется в электрический сигнал.
Существенным является
выбор светофильтров: светофильтр для возбуждения флуоресценции должен пропускать свет только в области поглощения исследуемого вещества и не должен пропускать свет в области, в которой образец флуоресцирует. Фильтр эмиссии должен пропускать флуоресценцию, но возбуждающий свет должен полностью им поглощаться. Подбирая такую пару светофильтров, следует добиваться их хорошей скрещенности: эти два светофильтра, сложенные вместе, совсем не должны пропускать свет.
Объекты анализа во флуориметрическом методе:
- нуклеиновые кислоты;
-
белки;
-
антитела, меченые флуоресцеином;
-
алкалоиды;
-
стероидные гормоны;
-
витамины (рибофлавин, тиамин, никотинамид, аскорбиновая кислота и т.д.);
-
ионы металлов;
-
лекарственные препараты (хинин, морфин, индометацин и др.);
-
токсичные вещества;
-
высокомолекулярные соединения.
Области применения флуориметров:
- фармацевтическая промышленность (контроль качества препаратов, компонентный анализ проб);
-
медицина (иммунологические исследования, диагностика заболеваний, изучение патогенеза);
-
криминалистика (определение следов токсичных веществ, подлинности документов и т.п.);
-
пищевая промышленность (количественное определение добавок, контроль качества упаковки);
-
санитарно-эпидемиологический контроль (контроль качества пищевых продуктов, воды, содержание вредных веществ в воздухе);
-
экологические исследования (оценка загрязнений почв и рек);
-
водоснабжение и энергетика;
-
химическая промышленность.
Преимущества флуориметрического метода:
- высокая чувствительность: определение концентраций до 10⁻⁹-10⁻⁸ моль/л (в 10-100 раз выше, чем у фотометрических методов);
-
небольшой объем анализируемой пробы;
-
специфичность: характер спектра флуоресценции, а также цвет излучаемого света специфичны для флуоресцирующих веществ, поэтому флуоресценция может быть применена для их идентификации;
-
широкая область применения: с помощью химических превращений можно придать флуоресцентные свойства веществам, не являющимся флуорофорами
-
сохранение образца (недеструктивность);
-
по сравнению со спектрофотометрией: простое устройство прибора, возможность варьирования чувствительности в широком диапазоне за счет усиления тока фотоумножителя, результат определяется по калибровочной кривой (не требуется кювета сравнения).
Недостатки флуориметрического метода:
- многие флуорофоры не флуоресцируют в воде;
-
изменение pH раствора может влиять на интенсивность свечения;
-
высокая концентрация кислорода в растворе подавляет флуоресценцию;
-
присутствие посторонних частиц может искажать сигнал (поглощение доли возбуждающей энергии, многократное отражение и т.д.);
-
многие флуорофоры подвержены фоторазложению.
Люминометры используются для регистрации интенсивности излучения, возникающего в результате реакций био- и хемилюминесценции, которые катализируются, например, перкосидазой хрена, люциферазами светляков и бактерий. Характерная особенность люминометров — отсутствие источника света, поскольку свечение образца индуцируется химической реакцией или другим способом.
Одно из основных применений
люминометра — определение уровня аденозинтрифосфата (АТФ), универсальной энергетической молекулы, находящейся во всех растительных, животных и бактериальных клетках, в том числе дрожжах и плесени. В результате биохимической реакции фермента люциферин/люцифераза с молекулами АТФ генерируется холодный свет, интенсивность которого регистрирует люминометр. Уровень АТФ измеряется в относительных световых единицах — RLU. Одной единице RLU соответствует 10⁻¹⁵ моль АТФ. Концентрация АТФ на поверхностях свидетельствует
о наличиии микробной обсемененности, таким образом,
люминометрия — быстрый и простой способ токсико-гигиенического мониторинга объектов.
Другие области применения люминометров:
- иммуноферментный анализ;
-
анализ репортерных генов;
-
анализ АТФ;
-
анализ апоптоза;
-
анализ токсичности и мутагенности.
В данном разделе представлены лабораторные
флуориметры/люминометры для проведения измерений в диапазоне от 270 до 670 нм на планшетах от 6 до 384 лунок, в пробирках, виалах, чашках Петри. Специальная конструкция приборов позволяет устанавливать до 8 интерференционных фильтров и работать в широком диапазоне спектра. Приборы могут быть оснащены встроенным шейкером и инкубатором, принтером, а также автоматическими дозаторами (до 3 шт.). Для проведения точных спектральных измерений (регистрации спектров люминесценции или спектров возбуждения люминесценции) применяются
спектрофлуориметры. Микробиологическую загрязненность можно контролировать с помощью
люминометров АТФ,
микробиологических экспресс-тестов.