Интегрированный секвенатор Ion Torrent Genexus — это высокопроизводительная система секвенирования следующего поколения, которая объединяет подготовку библиотеки, создание шаблонов и секвенирование в однодневный автоматизированный запуск на одном приборе.

• Время однополосного запуска — 14 часов (от 24 до 30 часов для полного чипа), до 32 образцов за цикл;
• до четырех одновременных анализов на чипе GX5 за один запуск (максимум 60 млн. прочтений);
• гибкое и экономичное планирование прогонов с использованием многополосных, многопроходных чипов секвенирования;
• автоматическая подготовка библиотек;
• автоматическая загрузка частиц Ion Sphere и создание шаблонов;
• отслеживание расходных материалов в режиме реального времени с помощью инструмента для определения загрузки расходных материалов во время настройки прогона;
• расходные материалы можно использовать в течение 14 дней после загрузки в прибор.

Наборы SENSE mRNA-Seq Barcode Kit for Ion Torrent предназначены для мультиплексирования при получении библиотек с помощью наборов SENSE для РНК-секвенирования на платформе Ion Torrent.

В каждый набор входит 12 баркодов, позволяющих объединять в библиотеку до 8 или 24 образцов. Пришивка баркодов происходит на стадии обратной транскрипции-лигирования. Баркоды представляют собой 17-нуклеотидные последовательности на 5’-концах ридов; 9 уникальных нуклеотидов фланкированы справа и слева константными 4-нуклеотидными структурами (TCAG-баркод-CGAT).

Наборы SENSE mRNA-Seq Barcode Kit for Ion Torrent предназначены для мультиплексирования при получении библиотек с помощью наборов SENSE для РНК-секвенирования на платформе Ion Torrent.

В каждый набор входит 12 баркодов, позволяющих объединять в библиотеку до 8 или 24 образцов. Пришивка баркодов происходит на стадии обратной транскрипции-лигирования. Баркоды представляют собой 17-нуклеотидные последовательности на 5’-концах ридов; 9 уникальных нуклеотидов фланкированы справа и слева константными 4-нуклеотидными структурами (TCAG-баркод-CGAT).

Набор для приготовления библиотек для секвенирования определённой (+ или -) цепи мРНК, включающий все необходимые компоненты.

Эти библиотеки предназначены для следующих задач:

• построение точного экспрессионного профиля;
• секвенирование транскриптома;
• выявление и количественная оценка антисмысловых транскриптов и перекрывающихся генов.

Исходным материалом для получения библиотек является суммарная РНК. С помощью набора SENSE можно получать библиотеки для секвенирования на платформе Ion Torrent (аналогичный набор предлагается для платформы Illumina). Предусмотрена возможность мультиплексирования – могут использоваться инлайн-баркоды (Cat. No. 007.08 и 007.24), позволяющие объединять в одну библиотеку до 24 образцов.

В состав набора входят все необходимые компоненты для подготовки библиотеки:

• набор реагентов для получения библиотеки;
• комплект для обогащения мРНК Poly(A) RNA Selection Kit;
• набор буферов и колонок для очистки РНК;
• дополнительные реагенты не требуются.

При получении библиотеки с помощью наборов SENSE используется технология замещения цепи stop/ligation. В отличие от технологии переключения цепи в протоколах с фрагментацией, эта технология даёт минимальное количество антисмысловых артефактов, что делает наборы SENSE незаменимыми при цепь-специфичном секвенировании РНК и выявлении антисмысловых транскриптов.

Входящий в набор Poly(A) RNA Selection Kit (его можно также приобрести отдельно) обеспечивает эффективную элиминацию рибосомальной РНК. Доля ридов рРНК составляет не более 0.001%.

Набор предназначен для получения библиотек, содержащих 3’-концевые последовательности полиА+мРНК, для секвенирования на платформе Ion Torrent. При этом риды генерируются в направлении 3’-концов, отражая истинную последовательность мРНК.

Для получения библиотеки достаточно 5 нг суммарной РНК, в том числе деградированной (например, из FFPE-образцов). Специфичность цепи при секвенировании составляет не менее 99.9%, что позволяет картировать риды на соответствующую цепь геномной ДНК. Это позволяет выявлять антисмысловые транскрипты и перекрывающиеся гены. Процесс получения библиотеки занимает около 4.5 часов.

Поскольку каждый транскрипт даёт только один фрагмент, не требуется нормализация по длине. Это позволяет количественно анализировать экспрессию генов с высокой точностью.

Для получения мультиплексных библиотек в состав наборов входит 24 баркода (набор А или набор В). Таким образом, в одну библиотеку можно загрузить до 48 образцов.

Набор предназначен для получения библиотек, содержащих 3’-концевые последовательности полиА+мРНК, для секвенирования на платформе Ion Torrent. При этом риды генерируются в направлении 3’-концов, отражая истинную последовательность мРНК.

Для получения библиотеки достаточно 5 нг суммарной РНК, в том числе деградированной (например, из FFPE-образцов). Специфичность цепи при секвенировании составляет не менее 99.9%, что позволяет картировать риды на соответствующую цепь геномной ДНК. Это позволяет выявлять антисмысловые транскрипты и перекрывающиеся гены. Процесс получения библиотеки занимает около 4.5 часов.

Поскольку каждый транскрипт даёт только один фрагмент, не требуется нормализация по длине. Это позволяет количественно анализировать экспрессию генов с высокой точностью.

Для получения мультиплексных библиотек в состав наборов входит 24 баркода (набор А или набор В). Таким образом, в одну библиотеку можно загрузить до 48 образцов.

Серия Ion GeneStudio S5 — это линейка высокоскоростных полупроводниковых настольных систем секвенирования следующего поколения (NGS). Имеется возможность масштабирования производительности на одной платформе, в зависимости от задач исследования, путем выбора одного из пяти чипов Ion Torrent. Возможность автоматической подготовки библиотеки, подготовки шаблона и загрузки чипа с использованием системы Ion Chef.

• Совместимые чипы — Ion 510, Ion 520, Ion 530, Ion 540, Ion 550;
• время секвенирования от 2,5 до 4 часов;
• ПО Torrent Suite — первичный анализ данных, Ion Reporter — вторичный анализ и аннотация данных;
• при использовании чипов Ion 540 и Ion 550 анализ результатов с первого чипа производится одновременно со вторым запуском;
• размеры, Ш × Г × В, см — 54,2 × 80,6 × 50,9;
• вес — 63,5 кг.

Производительность и время запуска:

Тип чипа	Количество прочтений, млн	Длина прочтения (выход)	Время секвенирования и анализа (суммарно), часы
Ion 510	2-3	200 п.н. 0,3–0,5 Гб	3
		400 п.н. 0,6–1 Гб	5
Ion 520	4-6	200 п.н. 0,6–1 Гб	3
		400 п.н. 1,2–2 Гб	5,5
	3-4	600 п.н. 0,5–1,5 Гб	5,5
Ion 530	15-20	200 п.н. 3–4 Гб	4
		400 п.н. 6–8 Гб	6,5
	9-12	600 п.н. 1,5–4,5 Гб	7
Ion 540	60-80	200 п.н. 10–15 Гб	6,5
		200 п.н. 20–30 Гб 2 запуска в день	10
Ion 550	100-130	200 п.н. 20–25 Гб	8,5
		200 п.н. 40–50 Гб 2 запуска в день	12

Серия Ion GeneStudio S5 — это линейка высокоскоростных полупроводниковых настольных систем секвенирования следующего поколения (NGS). Имеется возможность масштабирования производительности на одной платформе, в зависимости от задач исследования, путем выбора одного из пяти чипов Ion Torrent. Возможность автоматической подготовки библиотеки, подготовки шаблона и загрузки чипа с использованием системы Ion Chef.

• Совместимые чипы — Ion 510, Ion 520, Ion 530, Ion 540, Ion 550;
• время секвенирования от 2,5 до 4 часов;
• ПО Torrent Suite — первичный анализ данных, Ion Reporter — вторичный анализ и аннотация данных;
• размеры, Ш × Г × В, см — 54,2 × 80,6 × 50,9;
• вес — 63,5 кг.

Производительность и время запуска:

Тип чипа	Количество прочтений, млн	Длина прочтения (выход)	Время секвенирования и анализа (суммарно), часы
Ion 510	2-3	200 п.н. 0,3–0,5 Гб	3
		400 п.н. 0,6–1 Гб	5
Ion 520	4-6	200 п.н. 0,6–1 Гб	3,5
		400 п.н. 1,2–2 Гб	5,5
	3-4	600 п.н. 0,5–1,5 Гб	5,5
Ion 530	15-20	200 п.н. 3–4 Гб	5
		400 п.н. 6–8 Гб	8
	9-12	600 п.н. 1,5–4,5 Гб	8
Ion 540	60-80	200 п.н. 10–15 Гб	10
		200 п.н. 20–30 Гб 2 запуска в день	20
Ion 550	100-130	200 п.н. 20–25 Гб	11,5

Серия Ion GeneStudio S5 — это линейка высокоскоростных полупроводниковых настольных систем секвенирования следующего поколения (NGS). Имеется возможность масштабирования производительности на одной платформе, в зависимости от задач исследования, путем выбора одного из пяти чипов Ion Torrent. Возможность автоматической подготовки библиотеки, подготовки шаблона и загрузки чипа с использованием системы Ion Chef.

• Совместимые чипы — Ion 510, Ion 520, Ion 530, Ion 540;
• время секвенирования от 2,5 до 4 часов;
• ПО Torrent Suite — первичный анализ данных, Ion Reporter — вторичный анализ и аннотация данных;
• размеры, Ш × Г × В, см — 54,2 × 80,6 × 50,9;
• вес — 63,5 кг.

Производительность и время запуска:

Тип чипа	Количество прочтений, млн	Длина прочтения (выход)	Время секвенирования и анализа (суммарно), часы
Ion 510	2-3	200 п.н. 0,3–0,5 Гб	4,5
		400 п.н. 0,6–1 Гб	10,5
Ion 520	4-6	200 п.н. 0,6–1 Гб	7,5
		400 п.н. 1,2–2 Гб	12
	3-4	600 п.н. 0,5–1,5 Гб	12
Ion 530	15-20	200 п.н. 3–4 Гб	10,5
		400 п.н. 6–8 Гб	21,5
	9-12	600 п.н. 1,5–4,5 Гб	21
Ion 540	60-80	200 п.н. 10–15 Гб	19

BluePippin — система препаративного электрофореза и пульс-электрофореза, позволяет разделять и выделять фрагменты НК, размером 90-50000 п.н., а так же белки массой 18-200 кДа.

• Одновременный прогон до 5 образцов;
• напряжение при электрофорезе, В — 25, 100 и 150 (постоянный ток), или 100 в режиме пульс-электрофореза;
• ток (на каждую дорожку), мА — 2 или 3;
• длина волны возбуждения, нм — 470;
• длина детекции, нм — 525;
• максимальная нагрузка фрагментированной геномной ДНК на дорожку, мкг — 5;
• минимальная нагрузка фрагментированной геномной ДНК на дорожку, нг — 15;
• размер ДНК - 100 bp - 50 kb;
• точность выделения, % - > 93;
• воспроизводимость выделения, % - > 92;
• минимальное распределение по размерам, % - 8;
• выход образца, % - 50-80;
• габариты, ШхГхВ, см — 28х53х18;
• вес, кг — 7.

Области применения:

• приготовление библиотек при проведении NGS на секвенаторах ДНК HiScan SQ, HiSeq 2000, MiSeq (Illumina);
  5500 xl W, 5500w, Ion Torrent IonProton, Ion Torrent PGM (Life Technologies);
  GS FLX+, GS Junior (Roche);
• подготовка образов для парноконцевого секвенирования, ChIP-секвенирования;
• улучшение библиотек при проведении эмульсионной ПЦР с помощью систем QX100 и QX200 с автоматической системой генерации капель (Bio-Rad);
• выделение НК и белков.

Принцип работы: в системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК-маркера.

4 режима программирования:

1. Tight (узкий) – сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров.
2. Range (диапазон) – пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
3. Time (время) – коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
4. Peak (пик) – сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).

3 стратегии детектирования фракций:

• Для ДНК малых размеров (90 п.н. -1,5 тыс.п.н.):
  Стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые маркеры ДНК, определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.
• Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п.н.):
  Стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый маркер ДНК определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
• Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п.н.):
  Окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.

Преимущества метода:

• Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов.
• Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования.
• Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации.
• Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов.
• Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.

Схема работы:

1. Пробоподготовка:
• Подготовка материала, если используются внутренние стандарты: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл флуоресцентно - меченного маркера.
• Подготовка материала, если используется внешний стандарт: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл загрузочного раствора. 40 мкл готового стандарта помещается в отдельную дорожку.
• В случае с красителем Midori Green, 40 мкл красителя помещается в каждую из пяти + буферную камеру и при включении тока будет двигаться на встречу образцам.
2. Эксперимент:
• Выбираем картридж в соответствии со стратегией, с помощью которой будет производиться детектирование НК;
• помещаем картридж в прибор и выбираем её в ПО из списка предложенных программой (ПО само установит все необходимые параметры для проведения электрофореза под выбранный картридж);
• По истечении времени, заданного программой, образец аккуратно собираем из коллектора фракций пипеточным дозатором.

Информация о свежих статьях:

1. Nature Methods. Assembly and diploid architecture of an individual human genome via single-molecule technologies (июнь, 2015); Authors: Matthew Pendleton, Robert Sebra, Andy Wing Chun Pang, Ajay Ummat et al.
2. BioTechniques. Optimization and cost-saving in tagmentation-based mate-pair library preparation and sequencing. (май, 2015) DOI:10.1038/nmeth.3454; Authors: Kaori Tatsumi, Osamu Nishimura, Kazu Itomi, Chiharu Tanegashima, and Shigehiro Kuraku.

Видео:
Системы препаративного электрофореза BluePippin и Pippin Prep

Для проведения пульс-электрофореза применяется специальный источник питания Pippin Pulse.

Идентификация видов, присутствующих в образцах пищевых продуктов и кормах, является важным критерием для подтверждения подлинности, проверки происхождения, отслеживаемости сырья и для контроля качества процессов обработки на линиях производства.

Рабочий процесс Thermo Scientific NGS Food использует технологию секвенирования следующего поколения Ion Torrent для обеспечения нецелевого подхода к скринингу, позволяющего идентифицировать виды, содержащиеся в пищевых образцах как однокомпонентного, так и многокомпонентного сырья, путем сравнения с базой данных ДНК видов мяса, растений или рыб.

Ключевая особенность секвенатора ДНК 2-го поколения Ion GeneStudio S5:

• сокращение времени работы и сложности – реактивы plug-and-play на основе картриджа;
• быстрое получение результатов анализа – полный цикл секвенирования и анализ за часы;
• гибкая пропускная способность – выбрать чип, соответствующий вашим требованиям к пропускной способности (набор микросхем Ion 510 или 520 для идентификации видов пищевых продуктов).

Система Ion GeneStudio S5 использует скорость полупроводникового секвенирования, которая обеспечивает получение высококачественных данных секвенирования за несколько часов и позволяет перейти от библиотеки ДНК к данным всего за 24 часа. Благодаря однодневной установке, простому пользовательскому интерфейсу и картриджам с реагентами система Ion GeneStudio S5 проста и удобна в использовании.

Преимущества автоматизированного NGS-скрининга для мультивидовой идентификации:

• детекция всех мишеней (мясо, рыба и растения) в одном запуске;
• надежные результаты образцов из нескольких категорий продуктов питания (готовые к употреблению блюда, свежие продукты, супы, консервы и т. д);
• реагенты на основе картриджей «включай и работай»;
• быстрые результаты – полный цикл секвенирования и анализ за 24 часа;
• секвенирование ДНК – наиболее достоверный метод для подтверждения вида;
• методика определения вида методом секвенирования соответствует международному стандарту ISO TC 34/SC 16 ISO 22949-1 и ГОСТ 34106-2017.

Набор для приготовления библиотек для секвенирования определённой (+ или -) цепи мРНК, включающий все необходимые компоненты.

Эти библиотеки предназначены для следующих задач:

• построение точного экспрессионного профиля;
• секвенирование транскриптома;
• выявление и количественная оценка антисмысловых транскриптов и перекрывающихся генов.

С помощью набора SENSE можно получать библиотеки для секвенирования на платформе Illumina (также имеется аналогичный набор для Ion Torrent). Исходным материалом для получения библиотек является суммарная РНК. В состав набора входят индексы i7 (7001-7096) для бар-кодирования, а также предусмотрена возможность использования четырёх внешних индексов i5 (Dual Indexing Add-on Kit, Cat. No. 047). Это позволяет объединять до 384 образцов в одну библиотеку. Всего доступно 9216 комбинаций для секвенирования на платформе Illumina.
В состав набора входят все необходимые компоненты для подготовки библиотеки:

• набор реагентов для получения библиотеки;
• комплект для обогащения мРНК Poly(A) RNA Selection Kit;
• набор индексов для бар-кодирования Lexogen i7 6 nt Index Set (7001-7008, 7001-7024 или 7001-7096, в зависимости от размеров набора);
• набор с магнитными частицами для очистки РНК;
• дополнительные реагенты не требуются.

При получении библиотеки с помощью наборов SENSE используется технология замещения цепи stop/ligation. В отличие от технологии переключения цепи в протоколах с фрагментацией, эта технология даёт минимальное количество антисмысловых артефактов, что делает наборы SENSE незаменимыми при цепь-специфичном секвенировании РНК и выявлении антисмысловых транскриптов.

Входящий в набор Poly(A) RNA Selection Kit (его можно также приобрести отдельно) обеспечивает эффективную элиминацию рибосомальной РНК. Доля ридов рРНК составляет не более 0.001%.