Введение гена каталитического компонента теломеразы (hTERT) в клетки с различным дифференцировочным потенциалом

Дашинимаев Эрдэм Баирович

Специальность 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культуры клеток

Первичная культура мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека (X1), была получена из мононуклеарной фракции аспирата костного мозга подвздошной кости человека. Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина.

Первичная культура клеток стромы губчатой кости человека (BMSCS), полученная из трепаната верхней челюсти, была любезно предоставлена С.М. Тереховым (МГНЦ РАМН). Клетки культивировали на среде DMEM с добавлением 10% FBS, 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина.

Первичная культура мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека (LA) была любезно предоставлена С.М. Тереховым. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 15% FBS и 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина.

Первичная культура фетальных нейральных стволовых клеток человека (NSC) была любезно предоставлена И.Н. Сабуриной (ИБГ РАН). Клетки культивировали на среде DMEM/F12 с добавлением 2% Fetal Clone III, 10 нг/мл FGF-2, 10 нг/мл EGF, 0,11 мг/мл пирувата натрия, N2 Supplement, 0,32 мг/мл глутамина, 40 ед/мл гентамицина.

Клетки линии TK-164 (почечная карцинома человека) были любезно предоставлены М.Кост-Алимовой (Каролинский институт, Швеция). Клетки TK-164 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,32мг/мл глутамина и 40ед/мл гентамицина.

Все типы клеток культивировали в СО₂-инкубаторе с пониженным содержанием кислорода, в условиях +37°С, 5%СО₂, 3%О₂.

Трансфекция гена каталитического компонента теломеразы

Лентивирусная конструкция, содержащая ген hTERT под CMV промотором была любезно предоставлена П.М. Чумаковым (ИМБ РАН) (Рис. 1).

Введение гена осуществляли в растущие клетки. После удаления культуральной среды к растущим во флаконах клеткам на стадии половины монослоя добавляли вирусный концентрат (1 мл с титром 10⁸/мл), разведенный полной ростовой средой с сывороткой в соотношении 1:2. Эта смесь содержала также 5 мкг/мл полибрена. Клетки инкубировали в течение ночи, после чего среду меняли на полную ростовую среду. Эффективность лентивирусной трансфекции (по параллельному введению конструкции с зеленым флуоресцирующим белком) составляла не менее 80%.

Анализ дифференцировки клеток и иммуноцитохимические методы

Для индукции клеток к дифференцировке в адипогенном направлении, использовали полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением 1 мкM дексаметазона, 0,5 мM 3-изобутил-1-метилксантина и 1 мкг/мл инсулина. Среду меняли через каждые 3-4 дня. Образование характерных жировых клеток начиналось через 7-10 дней от начала дифференцировки. После 21 дня культивирования с индукционной средой клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали 4% формальдегидом 10 мин при комнатной температуре, после чего опять промывали PBS и окрашивали Суданом-IV 10 мин при комнатной температуре.

Для индукции клеток к дифференцировке в остеогенном направлении мы использовали полную ростовую среду (DMEM, 10%FBS) с добавлением 0,1 мкM дексаметазона, 10 мM β-глицерофосфата, 100 мкМ фосфата аскорбиновой кислоты. Среду меняли каждые 3-4 дня. После 14 дней культивирования с индукционной средой клетки промывали PBS, фиксировали 4%-ым формальдегидом 10 мин при комнатной температуре, промывали PBS и окрашивали 2% Ализариновым красным (pH 4.2) 10 мин при комнатной температуре.

Иммуноцитохимия. Клетки высаживали на покровные стекла в 6-луночных или 24-луночных планшетах (Costar, США). Перед фиксацией стекла с клетками дважды промывали PBS, фиксировали 4% формальдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре, затем дважды промывали PBS. Перед окрашиванием антителами стекла в течение 2 часов при комнатной температуре обрабатывали блокирующим раствором (PBS c добавлением 10% FBS, 0,1% Triton-X-100, 0,01% Tween-20). Наносили первые моноклональные антитела (разведенные в концентрации 1/100-1/500 от стоковой), инкубировали 2 часа при +37°С и промывали 3 раза PBS. Затем наносили вторые антитела с флуоресцентным красителем (разведенными в концентрации 1/500-1/1000 от стоковой), инкубировали 1 час при +37°С и отмывали 3 раза PBS. Далее препараты с клетками окрашивали раствором Хехста (3 мкг/мл на PBS) или DAPI (1,5 мкг/мл на PBS) 15 мин при комнатной температуре, промывали дистиллированной водой и заключали в 85% глицерин на PBS. Фотографировали препараты с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus BX61 и инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus CKX41.

Выявление белкового компонента теломеразы in situ. Для иммунохимического анализа клеток на экспрессию белка каталитического компонента теломеразы использовались моноклональные мышиные IgM антитела ab5181 фирмы Abcam (Англия). Процедуру окрашивания антителами проводили в соответствии с инструкцией производителя.

Изучение кариотипа

Для приготовления хромосомных препаратов из митотических клеток человека использовали культуры клеток, находящихся в активном делящемся состоянии, с наибольшим количеством митозов (обычно на 2-ой день после пересева). В начале процедуры клетки инкубировали в присутствии 0,1 мкг/мл колцемида в течении 2 часов, затем клетки снимали при помощи раствора трипсин-Версена, осаждали центрифугированием, промывали PBS и инкубировали в гипотоническом растворе 60 мM KCl при +37ºС в течении 1 часа с последующим осаждением на центрифуге. Далее клетки фиксировали в охлажденном до +4ºС фиксирующем растворе (ледяная уксусная кислота/метиловый спирт, 1:3) в течение 10 мин и меняли фиксирующий раствор на свежий. Полученную суспензию раскапывали на охлажденные до -20ºС предметные стекла с высоты 30 см, с последующим поджиганием фиксатора на стекле. Эта методика позволяет добиться оптимального распластывания митотических пластинок на поверхности предметного стекла. Полученные хромосомные препараты хранили сухими при комнатной температуре.

Дифференциальное R-окрашивание хромосом. Хромосомные препараты были окрашены при помощи флуоресцентных красителей: 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и 7-амино-актиномицина D (7-ААD). Для окрашивания хромосомных препаратов использовали рабочий раствор 7-ААD концентрацией 5 мкг/мл на PBS без кальция и магния, окрашивали в течение 30 мин, при комнатной температуре. Затем окрашивали раствором DAPI (5 мкг/мл на PBS) в течение 15 мин при комнатной температуре. Далее препараты промывали дистиллированной водой и заключали под покровные стекла в 85% глицерин на PBS. Окрашенные препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Olympus BX61. Полученная флуоресцентная окраска соответствует стандартному дифференциальному R-окрашиванию хромосом.

Определение экспрессии генов, методом ОТ-ПЦР

Выделение РНК. Для выделения РНК использовали коммерческий набор Invisorb®Spin Cell RNA Mini Kit, фирмы Invitek (Германия). На выходе данной процедуры получали выделенную и очищенную от ДНК тотальную РНК клеток в количестве 1-2 мкг/1 млн клеток.

Обратная транскрипция. Обратную транскрипцию мРНК осуществляли при помощи набора для синтеза первой цепи кДНК (олиго(dT)15) фирмы ЗАО «Силекс» (Россия, Москва).

ПЦР. Для проведения ПЦР исследуемых генов использовали коммерческий набор JumpStart Taq Ready Mix, D#7440, фирмы Sigma (США). Смесь полученного амплификата хранили при –20ºС и в дальнейшем анализировали при помощи стандартного агарозного гель-электрофореза.

Интернет-адреса банков праймеров, где были подобраны последовательности: https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html

http://medgen.ugent.be/rtprimerdb/

Идентификационные номера использованных праймеров: GAPDH (Primer Bank ID: 7669492a2), Nestin (PrimerBank ID: 35019a2), NSE (Primer Bank ID: 5803011a2), TH (RTPrimerDB ID: 3510), CHAT (RTPrimerDB ID: 3502), GFAP (PrimerBank ID: 4503979a1), PLP (Primer Bank ID: 19923104a1).

Определение теломеразной активности.

Для определения теломеразной активности использовали коммерческий набор «Trapeze Gel-Based Telomerase Detection Kit Assay» фирмы Chemicon, (США). Данный набор использует стандартный метод выявления теломеразной активности TRAP (telomeric repeat amplification protocol). Результаты реакции TRAP выявляли при помощи вертикального 10% ПААГ-электрофореза, в стандартном TBE буфере. Гель окрашивали бромистым этидием 0,5 мкг/мл – в течение 30 мин при покачивании, фотографировали через красный интерференционный светофильтр, с помощью цифровой камеры Nikon D70. Источником возбуждающего света УФ служил транс-иллюминатор.

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) теломерного повтора на хромосомах человека.

Хромосомные препараты получали по ранее описанной методике. Олигонуклеотиды (СССТАА)_4, меченные биотином, были заказаны в фирме «Силекс» (Россия). Хромосомные препараты обрабатывали раствором РНКазы А (10 мкг/мл) в течении 1 часа при 37ºС, после чего отмывали в PBS и высушивали на воздухе. Гибридизационный буфер с биотинилированными олигонуклеотидами (10-25 нг/мл меченых олигонуклеотидов, 50% формамида и 10% декстрансульфата в 2X буфере SSC) наносили на препараты в количестве 20 мкл и накрывали покровным стеклом. Затем препараты нагревали до +80°С 4 мин (этап денатурации) и инкубировали ночь при +37°С (этап гибридизации) во влажной камере. После этого препараты промывали 3 раза гибридизационным буфером при 42°С. Для выявления биотина использовали коньюгат стрептавидина с флуоресцентным красителем Cy-3. Хромосомы окрашивали DAPI по описанной ранее методике.

Тест на наличие контактного торможения пролиферации и реакции на сывороточное голодание.

Тест на контактное торможение пролиферации клеток проводили следующим образом: клетки высевали в 9 флаконов площадью 25 см², в количестве 100 тыс. клеток на флакон и культивировали в обычной полной ростовой среде, меняя среду через 3-4 суток. В процессе культивирования через каждые 2-3 суток (в зависимости от скорости роста культуры) из эксперимента выводили один флакон и подсчитывали количество клеток. Результатом теста является график роста культуры в зависимости от времени. Рост культуры клеток со способностью к контактному торможению имеет вид кривой «выходящей на плато».