Хроматография – от миллиграмма вещества до промышленного производства, GE

В последние десятилетия биотехнологические процессы все более активно применяются в производстве биологически активных веществ и, в частности, медицинских препаратов. Получение рекомбинантных белков, выделение биоло-гически активных веществ из природных источников, производство вакцин – вот далеко не полный перечень того, что сейчас используется для создания современных препаратов для защиты здоровья людей. Одной из важнейших в биотехнологическом процессе является стадия выделения и очистки целевого продукта, и в большинстве случаев оптимальным для достижения поставленной задачи является использование хроматографии. Хроматография позволяет получать чистые вещества из сложных многокомпонентных смесей с минимальными потерями.

Корпорация GE Healthcare, в состав которой вошла широко известная во всем мире компания Amersham Biosciences АВ, накопила огромный опыт в создании хроматографических систем и колонн, а также сорбентов для всех видов жидкостной хроматографии биомолекул. Эти приборы и материалы широко используются во всем мире для выделения и очистки белков и нуклеиновых кислот от стадии исследований в лаборатории до пилотного и промышленного производства. Ниже приведен краткий обзор хроматографических систем и сорбентов, выпускаемых корпорацией.

Самый простой из выпускаемых в настоящее время хроматографов – ÄKTAprime™ Plus. Он состоит из плунжерного насоса с системой клапанов, обеспечивающих формирование градиента подвижной фазы, встроенного контроллера (с пользовательскими и предустановленными протоколами выделения) и комбинированного УФ-детектора, работающего на фиксированной длине волны (254 или 280 нм, другие длины волн – опция) с датчиком проводимости и рН (опция) элюата. В системе имеется встроенный коллектор фракций. Максимальное рабочее давление в хроматографе 10 бар, скорость потока до 50 мл/мин. Результаты хроматографии могут регистрироваться на самописце или посылаться на компьютер для хранения и обработки (программой Pri-meView).

Более совершенная система ÄKTAFPLC™ состоит из прецизионного двойного шприцевого насоса, создающего давление до 50 бар и поток элюента до 20 мл/мин., миксера градиента и высококачественного УФ-детектора UPC-900 со встроенной ячейкой измерения проводимости и блоком измерения рН (опция). К хроматографу может подключаться коллектор фракций типа FRAC-920 или FRAC-950, при необходимости его можно укомплектовать дополнительными клапанами для увеличения возможностей системы.

Хроматографы ÄKTApurifier™ в минимальной комплектации включают двойной высокопроизводительный и прецизионный плунжерный насос Р-903 или Р-901, создающий давление 250 бар (100 бар) и скорость потока 10 мл/мин. (100 мл/мин). соответственно, миксер градиента и высококачественный УФ-детектор UV-900 с переменной длиной волны (190-700 нм) и возможностью регистрировать поглощение одновременно на трех длинах волн (возможна комплектация более дешевым детектором UPC-900). В комплект можно добавить рН-метр/кондуктометр рН/С-900 и необходимые для работы клапаны (для приготовления буферов, сбора фракций большого объема и т.д.). Наиболее совершенная система ÄKTAexplorer™ в дополнение к предыдущим опциям включает также клапаны для переключения колонок, выбора буферов, насос и клапан для ввода образцов, сенсор воздуха. ÄK-TAexplorer™ дает очень широкие возможности для отработки методики выделения белков и позволяет получать от миллиграммов до граммов чистого белка. Для пилотного производства производятся хроматографы ÄKTApilot™. Насосы этой системы создают поток элюента от 4 до 400 мл/мин (до 800 мл/мин – ограниченный градиент или изократика) при максимальном давлении до 20 бар, что позволяет выделять от миллиграммов до десятков граммов белка. В состав системы входит детектор UV-900, датчики проводимости и рН. В жидкостной линии находятся 4 датчика давления и 2 воздушных сенсора с ловушкой для предохранения хроматографической колонны от попадания в нее воздуха. важм отличием этого хроматографа от лабораторных систем ÄKTA является санитарная конструкция клапанов и соединений в соответствии с требованиями GLP и GMP. Это позволяет санитизировать все критические части системы, избегая таким образом кросс-контаминации. Промышленные хроматографы представлены несколькими моделями. Система ÄKTAprocess™ выпускается в трех вариантах по производительности: для потоков 4-180 л/час, 13-600 л/час и 45-1800 л/час с использованием полипропиленовых или нержавеющих труб, максимальное давление 6-10 бар в зависимости от материала и диаметра труб. ÄKTAprocess™ комплектуется компонен-тами (детектор, датчики, клапаны и т.д.) в соответствии с пожеланиями заказчика.

Хроматографы BioProcess™ производятся для работы при низком (3 бар), среднем (до 20-30 бар) и высоком давлении (до 80-150 бар) в колонне. Эти хроматографы способны создавать изократические или градиентные потоки элюэнта до 20000 л/час. Стандартная система может комплектоваться по желанию заказчика необходимым количеством входных и выходных линий с клапанами, датчиками давления, температуры, проводимости и рН.

Хроматографы ÄKTAprocess™ и BioProcess™ сконструированы в соответствии с требованиями GMP и позволяют проводить санитарную обработку и очистку внутренних и внешних поверхностей систем. Все перечисленные выше хроматографы (за исключением ÄKTAprime™ Plus) контролируются компьютером с помощью программы UNICORN™, управляющей всеми блоками и клапанами системы. Эта программа позволяет контролировать до четырех независимых систем, обсчитывать и анализировать получаемые результаты и создавать необходимые отчеты.

Лабораторные хроматографические колонки изготавливаются в основном из боросиликатного стекла с пластиковыми адапторами. Размеры колонок варьируют в широком диапазоне: диаметр от 5 до 50 мм, длина от 5 до 100 см, рабочее давление составляет от 1 до 100 бар, объем сорбента до 1862 мл. Выпускается большое количество предварительно упакованных колонок разной конфигурации (HiTrap™, HiPrep™, HiLoad™, Tricorn™) с различными сорбентами, что позволяет быстро подбирать подходящие сорбенты и условия элюции для решения конкретной хроматографической задачи.

Для пилотного производства производятся стеклянные колонны INdEX™, имеющие диаметр от 7 до 20 см и длину от 50 до 95 см, максимальный объем сорбента в колонне 25 л, максимальное давление 3 бар. Эти колонны не рекомендуется использовать в производстве фармпрепаратов.

Колонны BPG™ также изготовлены из стекла, конструктивно и по подбору материалов они соответствуют требованиям GMP и могут использоваться в фармпроизводстве. Колонны BPG™ имеют диаметр от 10 до 44.6 см и длину от 50 до 100 см, объем сорбента от 2 до 131 л. Максимальное давление составляет от 2.5 до 8 бар в зависимости от диаметра колонны. Промышленные колонны Chromaflow™ производят из акрилового полимера или по специальному заказу из нержавеющей стали. Их диаметр составляет от 40 до 200 см, максимальный объем сорбента 940 л, максимальное рабочее давление 3 бар. Отличительной особенностью колонн этого типа является конструкция верхнего и нижнего сопел, позволяющая удобно и эффективно осуществлять упаковку колонн сорбентом, хроматографическое разделение и распаковку колонн. Колонны FineLINE™ сделаны из нержавеющей стали и разработаны специально для использования мелкодисперсного сорбента SOURCE™. Гидравлическая система упаковки колонны позволяет быстро упаковывать ее сорбентом, достигая очень высокой эффективности. Колонны выдерживают давление до 20 бар и вмещают от 29 мл до 29 л сорбента. Колонны BioProcess™ MPLC (среднего давления) вмещают от 5.5 до 798 л сорбента и рассчитаны на работу при давлении до 20 бар (до 30 бар опция). Конструктивно они выполнены из нержавеющей стали и снабжены управляющим модулем, манометорм, предохранительным клапаном, клапанами для подвижной фазы и суспензии сорбента. Колонны BioProcess™ НPLC (высокого давления) используются для выделения и очистки небольших молекул и пептидов. Они имеют высоту 70 см и диаметр от 5 до 60 см, рабочее давление до 100 бар. Хроматографические сорбенты под торговыми названиями Sephadex™, Sepharose™, Superose™, Superdex™ и многие другие, выпускаемые фирмой, хорошо известны пользователям во всем мире. GE Healthcare производит сорбенты для всех видов жидкостной хроматографии: гель-фильтрации, ионного обмена, аффинной, гидрофобной и обращеннофазовой хроматографии. Гель-фильтрационные сорбенты включают как классический Sephadex™, применяемый в основном для обессоливания или замены буфера, так и высокоэффективные сорбенты Superdex™, Superose™, Sephacryl™ и Sepharose™, позволяющие проводить фракционирование в широком диапазоне размеров молекул – от 102 до 108 Да. Ионообменные сорбенты представлены сильными и слабыми катионообменными и анионообменными сорбентами на основе Сефарозы (Sepharose™ XL, Sepharose™ Fast Flow, Sepharose™ High Performance) для быстрой лабораторной и промышленной очистки белков, мелкодисперсными сорбентами на основе сополимера стирола и дивинилбензола (SOURCE™ 30, SOURCE™ 15, MonoBeads™, MiniBeads™) для эффективного разделения белков, сорбентами на основе сшитой агарозы серии Capto™ (Capto™ Q, Capto™ S, Capto™ MMC) для промышленной хроматографии. Номенклатура производимых аффинных сорбентов необычайно широка. Для выделения меченых белков выпускаются Ni Sepharose™, IMAC Sepharose™, Glutaione Sepharose™, IgG Sepharose™, Streptavidin Sepharose™, Calmodulin Sepharose™. Моноклональные и поликлональные антитела очищают с помощью сорбентов rProtein A Sepharose™, nProtein A Sepharose™, MabSelect™, Protein G Sepharose™, GammaBind Sepharose™, IgM и IgY Purification Media. Для выделения гликопротеинов производятся сорбенты Con A Sepharose™ и Lentil Lectin Sepharose™. Ферменты очищают на сорбентах DNA-Cellulose, Poly(A) Sepharose™, Poly(U) Sepharose™, Heparin Sepharose™, Blue Sepharose™, Arginine Sepharose™, Benzamidine Sepharose™, Glutatione Sepharose™. Для выделения нуклеиновых кислот используют Oligo(dT) Cellulose и Lysine Sepharose™. Кроме перечисленных выше, производится большая группа активированных сорбентов для обратимого химического связывания специфических молекул и для создания своих собственных аффинных сорбентов путем химической реакции лиганда с активными группами сорбента: NHS-activated Sepharose™, CNBr-activated Sepharose™, Activated CH Sepharose™, ECH и EAH Sepharose™, Epoxy activated Sepharose™, Thio-propyl Sepharose™, Activated Thiol Sepharose™. Для гидрофобной и обращеннофазовой хроматографии выпускаются сорбенты на основе Сефарозы (Phenyl Sepharose™, Octyl Sepharose™, Butyl Sepharose™ и Butyl-S Sepharose™) и сополимера стирола и дивинилбензола (SOURCE™ 15ETH, SOURCE™ 15ISO, SOURCE™ 15PHE для гидрофобной и SOURCE™ 5RPC, SOURCE™ 15RPC для обращеннофазовой хроматографии). Производится также сорбент на основе силикагельной матрицы с этил/октадецильным лигандом. Приведенный выше краткий перечень оборудования и сорбентов, выпускаемых GE Healthcare, дает лишь самую общую информацию о производимой продукции.