Агарозы - получение, свойства

Агароза - линейный компонент агара, точно так же, как и амилоза в крахмале. В агарозе для электрофореза/иммунодиффузии удалены остаточные сульфогруппы, которые в агаре присутствуют от природы (их удаляют для предотвращения электроэндосмоса при форезе), а в легкоплавкой агарозе (low melting point), определённые группы вводятся для изменения физических свойств.

Агароза — это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. В полимерной цепи агарозы чередуются beta-D-галактопираноза и 3,6-ангидро-alfa-L-галактопираноза. Молекулярная масса ее составляет 104—105. Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы образуют прочные гели уже при концентрации 0,3%. При температурах 84—96° (а у специальных типов—уже при 70°) раствор агарозы переходит в прозрачную жидкость — «плавится». Вязкость расплавленного 1%-ного раствора агарозы составляет 10—15 сП, что примерно соответствует вязкости 50%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре. Растворы агарозы характеризуются ярко выраженным гистерезисом: они затвердевают, образуя гель, при значительно более низких температурах (36—42°). У легкоплавких типов агарозы эта температура снижается до 30°. Такая особенность облегчает манипуляции с расплавленной агарозой—можно не опасаться преждевременного ее застывания в гель. Более того, расплавленную на кипящей бане агарозу предварительно охлаждают до 50—55° и уже при этой температуре дозируют и заливают в формы; это удобно и не связано с возникновением значительных тепловых деформаций.
Гели агарозы не вполне прозрачны, однако это обусловлено не наличием примесей, а своего рода «кристаллизацией» геля и свидетельствует, скорее, о чистоте агарозы. Затвердевший гель представляет собой не вполне равновесную систему: со временем он несколько уплотняется, выдавливая из себя жидкость. Этот процесс идет вначале довольно быстро, а потом — очень медленно. Тем не менее гели агарозы перед опытом следует выдерживать в течение, по крайней мере, 12 ч (открытые пластины для горизонтального электрофореза выдерживают во влажной камере). Сжатие сильнее выражено у более концентрированных «гелей агарозы.
Температуры плавления и гелеобразования зависят от содержания в агарозе метоксильных групп, которое может достигать 3—4%. Наличие этих групп затрудняет гелеобразование. В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза.
Разнообразные буферы, детергенты и другие добавки смешивают с раствором агарозы в горячем виде (при 50—60°). Они не препятствуют ее застыванию. Впрочем, надо иметь в виду, что высокая концентрация агентов,' диссоциирующих водородные связи, несколько затрудняет образование геля. Например, гели обычной агарозы с 6 М мочевиной плавятся за 1,5 мин при 75°, но не застывают за 1 ч. при 20° [Langridge et al., 1980]. Контакт с кислородом воздуха не мешает застыванию агарозы, поэтому плоские гели для горизонтального электрофореза готовят путем заливки дозированного объема расплавленной агарозы на строго горизонтальную стеклянную пластинку нужного размера. Тем не менее горячую смесь агарозы с буфером имеет смысл кратковременно деаэрировать под вакуумом.
Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний Размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует' диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гельфильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле…

Л.А.Остерман