Агарозы: Какие факторы необходимо учитывать при выборе типа агарозы

Какой концентрации готовить агарозный гель?

Наиболее часто используемая концентрация агарозного геля для разделения фрагментов нуклеиновых кислот (НК) колеблется в пределах 0,5-4 %. Концентрация геля выбирается в зависимости от типа агарозы и размера разделяемых фрагментов. Чем больше концентрация агарозы, тем меньше должны быть разделяемые фрагменты.

Есть ли различия в использовании ТАЕ и ТВЕ буферов для приготовления агарозного геля и последующего электрофореза?

Оба буфера могут быть использованы как альтернативные для любого типа агароз.

ТАЕ буфер обладает низкой ионной силой и буферностью, поэтому необходимо обновлять буфер (рециркуляция) при длительном электрофорезе. ТАЕ буфер рекомендован для разделения больших фрагментов (более 10 т.п.н.).

ТВЕ буфер обладает высокой ионной силой и буферностью, поэтому рециркуляция не требуется даже при длительном электрофорезе. ТВЕ буфер рекомендован для разделения небольших фрагментов (менее 1 т.п.н.) и фрагментов с небольшими отличиями в размере между собой.

Какой буфер рекомендован для аналитического электрофореза?

Можно использовать оба буфера, ТВЕ (0,5х или 1х) и ТАЕ (1х).

Какой буфер рекомендован для препаративного электрофореза?

Рекомендован ТАЕ буфер. Ионы борной кислоты в ТВЕ буфере взаимодействуют с гидроксильными группами полисахаридов, что может препятствовать выделению ДНК из геля для дальнейших манипуляций.

Насколько важно применять рециркуляцию буфера в процессе длительного электрофореза?

Рециркуляция препятствует образованию градиента рН и истощению буфера, таким образом, рециркуляция необходима при длительном электрофорезе в ТАЕ буфере из-за его низкой буферности.

Какой вольтаж использовать при проведении электрофореза?

Рекомендуется 4-10 вольт на см геля при горизонтальном электрофорезе. Если вольтаж слишком низкий, то подвижность фрагментов снижается и они расползаются. Если вольтаж слишком высокий, четкость разделения фрагментов снижается за счет перегревания геля.

Иногда фрагменты получаются кривые, волнистые. Чем это может быть вызвано?

Наиболее частая причина появления волнистых фрагментов – это прилипание остатков сухого геля к зубьям гребенки. Для предотвращения этого гребенка должна быть хорошо вычищена перед использованием. Рекомендуется подержать гель при 4 °С 30 минут, а также погружать застывший гель в буфер перед вытаскиванием гребенки.

Какое количество ДНК необходимо загружать на одну лунку?

Минимальное количество ДНК на лунку при детекции бромистым этидием составляет 10 нг. Максимальное количество ДНК на лунку составляет примерно 100 нг. Это количество может меняться, если вы используете другие красители ДНК. Для определения оптимального количества рекомендуется загрузить лунки с разным количеством ДНК (например, 10, 20, 30 нг и т.д.) и выбрать наиболее подходящий вам вариант.

Как следует готовить гель для получения лучшей четкости разделения фрагментов?

Рекомендуемая толщина геля 3-4 мм. Толщина гребенки тоже важна. Тонкая гребенка (1мм) дает хорошо различимые фрагменты, тогда как толстая гребенка дает широкие фрагменты, что снижает четкость.

Какой рекомендуется метод для приготовления агарозного геля?

Наиболее часто используют микроволновки для приготовления агарозного геля. Для высоких концентраций геля, когда высока вероятность образования пены, рекомендуется использовать водяную баню. Приготовления агарозного геля в автоклаве подходит для очень высоких концентраций, а также, когда нужен стерильный гель.

Как предотвратить образование пены во время приготовления агарозного геля?

Перед нагреванием рекомендуется оставить колбу с агарозой и буфером на 10-15 минут. Это уменьшит вероятность образования пены и сделает растворение агарозы более легким.