Цифровая ПЦР (digital PCR) – обзор современных решений

Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. Идея проведения такой ПЦР появилась в конце 90-х годов 20 века и окончательно воплотилась в жизнь к 2011 г, когда компания Bio-Rad представила научному сообществу первую работающую систему цифровой ПЦР.

Принцип действия цифровой ПЦР

Принцип нового метода заключается в разделении общей реакционной смеси на большое (десятки тысяч) количество отдельных микрореакций, в каждой из которых параллельно друг другу идет одна и та же ПЦР с молекулой ДНК (в идеале одной) которая случайно распределилась в данную микрореакцию. Главным отличием подобной ПЦР от количественной ПЦР-РВ является то, что ведется фактически качественный анализ присутствия в каждой лунке ампликонов в конечной точке по типу «да» / «нет» и при этом различия в выходе на плато процессов амплификации для амплифицируемых в разных лунках образцов никак не влияют на расчет количества исходных ампликонов. Фактически лунка с сигналом обозначается компьютерной «1», а лунка без сигнала – «0», то есть налицо бинарная запись результатов амплификации, ввиду чего данный вариант ПЦР и был назван цифровым.

Принцип действия цифровой ПЦР

Достоинства и применение цифровой ПЦР

Преимущества цифровой ПЦР перед ПЦР в «реальном времени»:

• не зависит от значения Ct, различия в эффективности ПЦР разных образцов оказывают значительно меньшее влияние на количественные результаты;
• позволяет детектировать единичные молекулы матрицы даже при низкой концентрации в образце (ввиду нанообъемов смеси);
• позволяет получить абсолютные значения (число копий на реакцию) без использования стандартной кривой;
• позволяет обнаружить редкий вариант мишени в сложном окружении (при qPCR сигнал редкой мутации легко теряется из-за менее эффективной амплификации).

Важно понимать! Цифровая ПЦР не заменяет ПЦР в «реальном времени», но значительно расширяет возможности исследователя!

Основные применения метода цифровой ПЦР

• Обнаружение редких мутаций в онкологии.
• Обнаружение редких патогенов.
• Подсчет вирусной нагрузки.
• Создание стандартов и референсных образцов.
• Обнаружение ГМО.
• Исследование копий генов.
• Анализ библиотек для NGS.
• Подтверждение результатов NGS.

Цифровая ПЦР от компании Bio-Rad

Bio-Rad – традиционно первая компания, освоившая производство систем для цифровой ПЦР. Принцип работы этих приборов отличается от других тем, что разбивка реакционной смеси на микрореакции происходит путем генерирования микрокапель в эмульсии (в связи с чем технология называется капельной цифровой ПЦР – droplet digital PCR). Затем смесь, разбитая на десятки тысяч микрокапель амплифицируется в стандартном термоциклере, после чего помещается в специальный ридер, в котором капли с прошедшей ПЦР проходят друг за другом через луч лазера.

Рабочий процесс капельной цифровой ПЦР Bio-Rad

Значительным преимуществом систем Bio-Rad перед аналогичными приборами является их высокая производительность. За запуск можно проанализировать до 96 или даже до 480 образцов, что может быть полезно тем пользователям у кого данный метод широко используется (например, фармпроизводства). Кроме того, используя для амплификации обычный планшетный термоциклер с градиентным блоком можно легко оптимизировать ПЦР под свои задачи. Однако одним из недостатков является значительное количество специальных расходных материалов для генерации реакционной смеси.

На данный момент доступны следующие варианты приборов:

Система QX200 для цифровой ПЦР в каплях, с ноутбуком и ПО – система состоящая из генератора капель, амплификатора и ридера флуоресценции. Предполагает ручные этапы подготовки реакционной смеси, переноса в планшет и загрузки в ридер.

Система QX200 для цифровой ПЦР в каплях, с автоматической системой генерации капель – осуществляет автозагрузку образцов в генератор капель, генерирует капли и автоматически переносит их в планшет для ПЦР, что уменьшает вероятность контаминации.

Система QX ONE для мультиплексного цифрового ПЦР в каплях, автоматическая, 4 канальная – моноблок, который автоматизирует каждый этап процесса цифровой капельной ПЦР, включая генерацию капель, амплификацию и анализ результатов в одном приборе. Прибор способен проводить амплификацию пяти 96-луночных планшетов одновременно, обеспечивая возможность анализа до 480 образцов за прогон. Система имеет четыре канала измерения флуоресценции; совместима со всеми мастер-миксами и наборами для цифровой ПЦР в каплях.

Также компания производит большое количество расходных материалов и готовых реагентов для своих систем.

Цифровая ПЦР от компании Thermo FS

В отличие от Bio-Rad компания Applied Biosystems (в настоящее время часть Thermo FS) реализовала в цифровой ПЦР в 2013 г другой принцип генерирования микрореакций, путем распределения реакционной смеси на кремниевой подложке, перфорированной на 20 000 микроотверстий.

Устройство чипа для цифровой ПЦР Applied Biosystems

Таким образом был создан чип для цифровой ПЦР и система для ее проведения QuantStudio 3D. Эта система также состоит из нескольких частей: загрузчик чипов (распределяющий по чипу реакционную смесь), амплификатор с плоским термоблоком для чипов и ридер флуоресценции. Несомненным преимуществом данной системы является загрузка одного образца на чип (что позволяет лаборатории с небольшим количеством исследований загружать столько чипов сколько у них на данный момент образцов), а также минимальное количество расходных материалов (все что нужно это набор чипов и оптимизированный мастер-микс для проведения цифровой ПЦР).

В конце 2021 года Thermo FS анонсировала новейшую систему для цифровой ПЦР в моноблочном исполнении QuantStudio Absolute Q – это прибор, который проводит все этапы цифровой ПЦР (распределение реакционной смеси, термоциклирование, детекция флуоресценции, анализ данных), определяет абсолютное количество мишени за 90 минут, анализируя более 95% образца, имеет простой процесс подготовки реакции сходный с пробоподготовкой при количественной ПЦР, и возможность мультиплексирования с использованием до четырех оптических каналов системы.

Распределение реакционной смеси осуществляется в специальных планшетах на 16 образцов (возможно масштабирование эксперимента 4,8,12 или 16 образцов), каждый образец распределяется прибором на 20 480 микрокамер. Кроме того, уникальность данной системы заключается в том, что она позволяет (в отличие от аналогов) использовать не менее 95% загружаемого образца, тем самым резко повышая статистическую значимость и точность получаемого результата (у других аналогичных систем от 30% до 70% загружаемого образца не используется в реакции).

Принцип распределения реакционной смеси в QuantStudio Absolute Q

Набор необходимых расходных материалов также минимален – нужны собственно планшеты MAP16 и оптимизированный мастер-микс.

Информация для заказа:

См. также:

ДНК-амплификаторы "в реальном времени"

ДНК-амплификаторы "классические"

Запаиватели, запечатыватели планшетов

Пленки, фольга, маты, воск для планшетов

Пробирки, планшеты для ПЦР

ПЦР-боксы

Ниже вы можете задать вопрос или оставить запрос в свободной форме