Цифровая ПЦР (digital PCR) – обзор современных решений

В клетке могут встречаться редкие мутации, например лишь в одной из нескольких сотен клеточных митохондриальных ДНК. В общей смеси при обычном ПЦР при таком сильном разведении эти мутации невозможно обнаружить. Похожая картина нередко наблюдается в отношении минорных опухолевых мутациях. Цифровой капельный ПЦР (Droplet Digital PCR) – усовершенствованный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), при котором реакционная смесь после добавления ДНК распыляется на множество мельчайших капель, попадающих на лунки чипа. Чип может содержать несколько десятков тысяч ячеек, на которых в каплях протекает ПЦР. При этом возможна визуализация результата реакции с каждой ячейки. По завершению реакции данный чип может быть использован для проведения секвенирования или клонирования с каждой капли.

Система QX200 Droplet Digital PCR предназначена для проведения цифровой капельной ПЦР третьего поколения, позволяющей добиться высочайшей точности и достоверности результатов. QX200 обеспечивает абсолютную количественную оценку ДНК- и РНК-мишеней как с помощью зондов так и с помощью интеркалирующего красителя EvaGreen, исключая использования калибровочных кривых .

Система включает в себя QX200 Droplet Generator (генератор микродисперсионных капель из кДНК или РНК-содержащих образцов) и QX200 Droplet Reader (позволяет осуществлять сверхчувствительный и точный автоматический анализ продуктов амплификации).

Преимущества цифрового капельного ПЦР по сравнению с RТ ПЦР:

• гибкость системы и оптимизация ее для EvaGreen и TaqMan зондов любых производителей;
• сверхчувствительность и сверхточность количественного анализа продуктов амплификации гена-мишени в каждой капле образца;
• фракционирование образцов на нанокапли сводит к минимуму влияние на результат исследований таких параметров как наличие ингибиторов ПЦР и эффективности;
• протекания амплификации за счет абсолютного подсчета гена-мишени в каждой капле;
• отсутствие необходимости использования калибровочных кривых;
• прямое обнаружение редкого варианта гена-мишени в сложном окружении.

Применения системы цифровой ПЦР QX200 Droplet Digital PCR:

• Количественная оценка биомаркеров рака. Мутациям, ассоциированным с онкологией, часто удаётся избежать детектирования из-за их низкой концентрации по сравнению с фоновой ДНК дикого типа в том же образце. За счёт высокой чувствительности система QX200 позволяет детектировать и количественно оценивать мутации в концентрациях от 0,0001% (!) - одна на сто тысяч.


• Обнаружение и оценка возбудителей заболеваний. Точная количественная оценка вирусной нагрузки крайне важна для определения состояния заболевания, разработки, утверждения и оценки эффективности терапии. QX200 обладает чувствительностью достаточной для обнаружения сверхмалых количеств вирусного генетического материала и в том числе и в сложных смесях


• Определение количества копий гена (CNV). Вариации числа копий гена (CNV) является значимым источником полиморфизма в геноме человека. CNV ассоциируется с раком, неврологическими и аутоиммунными заболеваниями, а также с побочными эффектами при воздействии лекарственных средств. QX200 позволяет определить CNV с точностью соотношения 1.2х (!), например, пять против шести.


• Валидация и количественная оценка библиотек NGS. С помощью технологии цифровой ПЦР можно качественно и количественно оценить библиотеку, что позволяет наиболее эффективно использовать секвенаторы.


• Анализ экспрессии генов. Капельная цифровая ПЦР позволяет количественно определить уровень экспрессии гена. Благодаря высокой точности и чувствительности метода возможна оценка минимального 10% (!) изменения экспрессии, в том числе и при низких концентрациях.


• Тестирование продуктов на наличие ГМО. С точностью до тысячных долей процента позволяет оценить количество генетически модифицированных ингредиентов в продуктах питания, сырье кормах.

Скачать список публикаций с использованием технологии капельной ПЦР

Скачать листовку о системе QX200 Droplet Digital PCR и её применении

Видео о цифровой ПЦР c использованием системы QX100 и ПО ddPCR

Этапы проведения эксперимента при использовании метода цифровой ПЦР.

Капельная цифровая ПЦР осуществляется в четыре последовательных этапа:

1. Подготовка реакционной смеси. Подготавливают 20 мкл реакционной ПЦР смеси для каждого образца, затем смесь помещают в пластиковый картридж QX200 droplet генератора.


2. Генерация капель. В соответствующие каналы картриджа заливается специальное минеральное масло, и наполненный картридж устанавливают в QX200 droplet генератор, где образцы и масло соединяются между собой по микро каналам внутри картриджа для получения эмульсии — около 20 000 монодисперсных капель для каждого из 8 подготовленных образцов. Объем каждой капли 1 нл.


3. Полимеразная цепная реакция. Эмульсионные образцы переносятся на стандартную 96-луночную плашку для ПЦР и амплифицируются с помощью стандартного термоциклера, например C1000 touch.


4. Считывание и анализ результатов. После завершения ПЦР плашка загружается в QX200 droplet ридер, который обеспечивает анализ флуоресцентного сигнала капель, детектируя каждую каплю по очереди и определяя, какие капли содержат мишень, а какие нет. Анализ результатов осуществляется с помощью программного обеспечения ddPCR.

Характеристики:

• Генератор капель водно-масляной эмульсии QX200 Droplet Generator:
• исходный объем образца, мкл ̶ 20;
• емкость, количество образцов/картридж ̶ 8;
• количество капель на образец ̶ 20 000;
• габариты, ШхГхВ, мм ̶ 280 х 360 х 130;
• вес, кг ̶ 4,5.


• Считыватель капель QX200 Droplet Reader:
• производительность, лунки/ч ̶ 32;
• количество капель на 96-луночный планшет, млн. ̶ ~1,5;
• облучение образца ̶ светоизлучающие диоды;
• линейный динамический диапазон, порядки ̶ 5;
• детектирование образца ̶ многопиксельный счетчик фотонов;
• каналы детектирования ̶ FAM (EvaGreen), HEX (VIC);
• точность ̶ ±10%;
• габариты, ШхГхВ, мм ̶ 660 х 520 х 290;
• вес, кг ̶ 26.

Сопутствующие разделы:

Станции выделения НК и белков

Наборы для выделения нуклеиновых кислот

Наборы для выделения нуклеиновых кислот, BioSilica

Спектрофотометры НАНО

ДНК-амплификаторы "классические"

Амплификаторы "в реальном времени"

В клетке могут встречаться редкие мутации, например, лишь в одной из нескольких сотен клеточных митохондриальных ДНК. В общей смеси при обычном ПЦР при таком сильном разведении эти мутации невозможно обнаружить. Похожая картина нередко наблюдается в отношении минорных опухолевых мутациях. Цифровой капельный ПЦР (Droplet Digital PCR) – усовершенствованный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), при котором реакционная смесь после добавления ДНК распыляется на множество мельчайших капель, попадающих на лунки чипа. Чип может содержать несколько десятков тысяч ячеек, на которых в каплях протекает ПЦР. При этом возможна визуализация результата реакции с каждой ячейки. По завершению реакции данный чип может быть использован для проведения секвенирования или клонирования с каждой капли.

Инновационная система QX200 Droplet AutoDG Digital PCR предназначена для проведения цифровой капельной ПЦР третьего поколения, позволяющей добиться высочайшей точности и достоверности результатов. Система включает в себя автоматический Droplet Generator (генератор микродисперсионных капель из кДНК или РНК-содержащих образцов) со встроенным цветным монитором, QX200 Droplet Reader (позволяет осуществлять сверхчувствительный и точный автоматический анализ продуктов амплификации) и Automated Droplet Generator, который автоматической загрузки образцов и дальнейшее его пипетирование на 96 луночный планшет в генераторе капель. Аппарат AutoDG имеет свой собственный кожух и фильтр НЕРА, что ведет к снижению вероятности загрязнения, поэтому система может быть использована на стандартном лабораторном столе, без необходимости применения бокса для ПЦР или чистой комнаты.

Преимущества цифрового капельного ПЦР по сравнению с RТ ПЦР:

• исключительная чувствительность;
• исключительная точность;
• отсутствие калибровочных кривых;
• прямое обнаружение редкого варианта мишени в сложном окружении;
• отсутствие эффекта первых циклов ПЦР;
• большая производительность;
• ручная работа предельно упрощена и сведена к минимуму;
• генерация капель для 96 образцов за 45 минут;
• HEPA-фильтры для снижения риска контаминации;
• цветной сенсорный экран с удобным программным обеспечением.

Применения системы цифровой ПЦР QX200 Droplet Digital PCR:

• Количественная оценка биомаркеров рака. Мутациям, ассоциированным с онкологией, часто удаётся избежать детектирования из-за их низкой концентрации по сравнению с фоновой ДНК дикого типа в том же образце. За счёт высокой чувствительности система QX200 позволяет детектировать и количественно оценивать мутации в концентрациях от 0,0001% (!) - одна на сто тысяч.


• Обнаружение и оценка возбудителей заболеваний. Точная количественная оценка вирусной нагрузки крайне важна для определения состояния заболевания, разработки, утверждения и оценки эффективности терапии. QX200 обладает чувствительностью достаточной для обнаружения сверхмалых количеств вирусного генетического материала и в том числе и в сложных смесях


• Определение количества копий гена (CNV). Вариации числа копий гена (CNV) является значимым источником полиморфизма в геноме человека. CNV ассоциируется с раком, неврологическими и аутоиммунными заболеваниями, а также с побочными эффектами при воздействии лекарственных средств. QX200 позволяет определить CNV с точностью соотношения 1.2х (!), например, пять против шести.


• Валидация и количественная оценка библиотек NGS. С помощью технологии цифровой ПЦР можно качественно и количественно оценить библиотеку, что позволяет наиболее эффективно использовать секвенаторы.


• Анализ экспрессии генов. Капельная цифровая ПЦР позволяет количественно определить уровень экспрессии гена. Благодаря высокой точности и чувствительности метода возможна оценка минимального 10% (!) изменения экспрессии, в том числе и при низких концентрациях.


• Тестирование продуктов на наличие ГМО. С точностью до тысячных долей процента позволяет оценить количество генетически модифицированных ингредиентов в продуктах питания, сырье кормах.

Этапы проведения эксперимента при использовании метода цифровой ПЦР.

Капельная цифровая ПЦР осуществляется в четыре последовательных этапа:

1. Подготовка реакционной смеси. Подготавливают 20 мкл реакционной ПЦР смеси для каждого образца, затем смесь помещают в пластиковый картридж QX200 droplet генератора.


2. Генерация капель. В соответствующие каналы картриджа заливается специальное минеральное масло, и наполненный картридж устанавливают в QX200 droplet генератор, где образцы и масло соединяются между собой по микро каналам внутри картриджа для получения эмульсии — около 20 000 монодисперсных капель для каждого из 8 подготовленных образцов. Объем каждой капли 1 нл.


3. Полимеразная цепная реакция. Эмульсионные образцы переносятся на стандартную 96-луночную плашку для ПЦР и амплифицируются с помощью стандартного термоциклера, например C1000 touch.


4. Считывание и анализ результатов. После завершения ПЦР плашка загружается в QX200 droplet ридер, который обеспечивает анализ флуоресцентного сигнала капель, детектируя каждую каплю по очереди и определяя, какие капли содержат мишень, а какие нет. Анализ результатов осуществляется с помощью программного обеспечения ddPCR.

Сопутствующие разделы:

Станции выделения НК и белков

Наборы для выделения нуклеиновых кислот

Наборы для выделения нуклеиновых кислот, BioSilica

Спектрофотометры НАНО

ДНК-амплификаторы "классические"

Амплификаторы "в реальном времени"

Система QX ONE предназначена для проведения точной и мультиплексированной цифровой капельной ПЦР. Это единый инструмент, который автоматизирует каждый этап процесса цифровой капельной ПЦР, включая генерацию капель, амплификацию и анализ результатов в одном приборе. Прибор способен проводить амлификацию пяти 96-луночных планшетов одновременно, обеспечивая возможность анализа до 480 образцов за прогон. Система имеет четыре канала измерения флуоресценции; совместима со всеми мастер-миксами и наборами для цифровой ПЦР в каплях. Встроенный 24-дюймовый сенсорный экран высокого разрешения позволяет легко программировать, выполнять мониторинг реакции для каждого планшета и проводить полный анализ данных. RFID-сканер и расходные материалы со штрих-кодами RFID обеспечивают быструю и простую настройку и отслеживаемость проведения операций.

Преимущества системы QX ONE для цифровой капельной ПЦР:

• автоматизация проведения реакции цифровой капельной ПЦР;
• амлификация 5-ти 96-луночных планшетов одновременно, до 480 образцов за прогон;
• расширенные возможности мультиплексирования: четыре цветовых канала в сочетании с амплитудным мультиплексированием и/или радиальным мультиплексированием позволяют обнаруживать множество уникальных целей в одной реакции;
• новый мультиплексный супермикс оптимизирован для расширения возможностей мультиплексирования;
• совместимость со всеми мастер-миксами и наборами для цПЦР в каплях;
• простое в использовании ПО QX ONE;
• интуитивно понятная настройка запуска прибора с использованием большого встроенного сенсорного экрана.

Характеристики системы QX ONE ddPCR:

• начальный объем образца, мкл - 20;
• максимальная пропускная способность - 480 образцов/прогон;
• количество капель на 20 мкл образца - 20 000;
• количество каналов измерения флуоресценции - 4;
• детектируемые каналы - FAM, HEX (VIC), Cy5, Cy5.5;
• термальный градиент - наличие;
• встроенный компьютер – сохраняет данные для 100 планшетов;
• время получения результата -6.5 часов для первого планшета, и приблизительно 4 часа для каждого последующего планшета, на основе стандартного 2-шагового протокола для капельной цифровой ПЦР;
• габариты, ШхГхВ, см - 122 х 66 х 38;
• вес, кг - 100 (включая монитор).

Применение QX ONE ddPCR:

• анализ экспрессии генов - достижение надежных и воспроизводимых результатов измерения небольших кратных изменений для мРНК и микроРНК в низкой концентрации;
• исследования биомаркеров рака и вариаций числа копий - измерение различных степеней мутаций при раковых заболеваниях, обнаружение редких копий ДНК-мишени;
• обнаружение патогена - предельная точность для количественной оценки небольших кратных изменений в молекулах ДНК или РНК-мишени при обнаружении и мониторинге патогена;
• секвенирование следующего поколения - выполнение ортогонального тестирования результатов NGS;
• экологический мониторинг - тестирование широкого спектра экологических образцов, например, таких как почва и вода;
• тестирование пищевых продуктов - выполнение рутинной оценки сложных генетически модифицированных организмов (ГМО) с использованием проверенных наборов и методов цифровой капельной ПЦР.

ДНК-амплификатор ProFlex с реакционным блоком Dual flat предназначен для использования с планшетами OpenArray (совместимы с системой ПЦР в реальном времени QuantStudio 12K Flex) и чипами 20K Chip для системы цифровой ПЦР QuantStudio 3D.
Модель совместима со сменными реакционными блоками других форматов (3×32×0,2 мл; 96×0,2 мл; 2×96×0,2 мл; 2×384×0,02 мл).
Поддерживает функцию симуляции температурных характеристик основных моделей ДНК-амплификаторов (BioRad C1000 Touch, BioRad MyCycler, Applied Biosystems 9700, Applied Biosystems 9600, Applied Biosystems Veriti).

• Реакционный блок — Dual flat (планшеты OpenArray/ чипы 20K Chip);
• допустимый объём образца — 33 нл;
• максимальная скорость нагрева/охлаждения блока — 1,6 °С/сек;
• без градиента температур и блока VeriFlex;
• подогреваемая крышка (до 105 °С);
• диапазон рабочих температур — 0-100 °C;
• точность поддержания температур — ± 0,25 °C;
• гомогенность температуры по блоку — ± 0,5 °C;
• цветной сенсорный дисплей 8,4 дюйма;
• USB-порт позволяет загружать программы с карт памяти;
• автоматический перезапуск при сбое в электропитании;
• порт RS232 для подключения датчика комплекта проверки температуры;
• поддержка WiFi и Thermo Fisher Connect позволяет загружать данные с мобильного устройства или компьютера;
• потребляемая мощность — 950 Вт;
• габариты (Ш × Г × В) — 330 × 565 × 272 мм;
• вес — 19,6 кг.

Комплект поставки: ДНК-амплификатор ProFlex с реакционным блоком Dual flat, один год гарантии.

Система QuantStudio Absolute Q – это единый прибор для всех этапов цифровой ПЦР, который позволяет проводить абсолютное определение количества мишени за 90 минут, анализируя более 95% образца, имеет простой процесс подготовки реакции сходный с пробоподготовкой при кПЦР, и возможность мультиплексирования с использованием до четырех оптических каналов системы.

Принцип цПЦР состоит в том, что реакционная смесь после добавления ДНК делится на множество микрореакторов, в каждом из которых проходит амплификация целевого участка ДНК. Некоторая часть этих реакций содержит целевую молекулу (положительный результат), в то время как другие не содержат (отрицательный результат). Соотношение количества положительных и отрицательных ПЦР используются для подсчета общего количества молекул образца. Таким образом цПЦР позволяет провести абсолютное количественное определение без потребности в калибровочных кривых.

В системе QuantStudio Absolute Q амплификация ДНК и оценка продуктов ПЦР проводятся на микрофлюидном планшете MAP16, обеспечивающем легкую и последовательную оцифровку 20 000 точно определенных микрореакторов. С менее чем 5% «мертвого» объема, система с высокой точностью определяет редкие мишени.

Области применения системы QuantStudio Absolute Q

• Обнаружение редких мутаций в онкологии;
• обнаружение редких патогенов, оценка вирусной нагрузки;
• создание стандартов и референтных образцов;
• мониторинг семян и продуктов на наличие ГМО контаминации;
• исследование копийности генов;
• анализ библиотек для NGS;
• подтверждение результатов NGS.

Технические характеристики системы QuantStudio Absolute Q

Система QuantStudio Absolute Q имеет следующие параметры:

• анализируемый выход, % – более 95;
• время прохождения амплификации, мин – 90;
• кол-во образцов за запуск – 16 (может быть запущен в формате 4, 8, 12, 16 образцов за запуск);
• объем реакционной смеси, мкл – 9;
• кол-во микрореакторов – 20 480;
• заполнение камеры с микрореакторами, % – 99;
• чувствительность, копий – 1–100,000;
• точность, % – ±10;
• количество каналов измерения флуоресценции – 4;
• совместимость с красителями – FAM, HEX, VIC, ABY, ROX, CY5, JUN;
• габариты, Ш × Г × В, см – 62 × 60 × 54;
• вес, кг – 60.

Комплектация QuantStudio Absolute Q

• Система для цПЦР QuantStudio Absolute Q;
• компьютер;
• стартовый набор: 12 планшетов MAP16, крышки для стрипов, изоляционный буфер, 5х ДНК мастер-микс, верификационный набор;
• гарантийное обслуживание – 1 год;
• 1 день обучения на площадке заказчика.