Oxford Nanopore Technologies: примеры применения технологии

10.08.2018

Стратегия сборки бактериальных геномов с помощью длинных ридов, получаемых при секвенировании на MinION
10.08.2018

Технологии секвенирования с получением коротких ридов сделали чтение генома микроорганизмов простым и дешёвым. Однако секвенирование кольцевых геномов часто требует больших затрат. Кроме того, сборка генома из коротких ридов может стать проблемой в случае повторов и GC-богатых структур. Технология, используемая в секвенаторе MinION, Oxford Nanopore, позволяет секвенировать одиночные молекулы ДНК неограниченной длины и решить вышеописанные проблемы (хотя весь потенциал этой технологии пока не раскрыт). В статье приводятся результаты секвенирования 9 бактериальных геномов, отличающихся GC-составом, полученных с помощью MiSeq, Illumina и MinION, Oxford Nanopore. Секвенирование с помощью двух различных технологий проводилось с целью выявления преимуществ каждой из них, а также возможности использования их сочетания. Геном, собранный из ридов, полученных только на MiSeq, отличается высокой точностью, но возникают проблемы с его целостностью. Эти проблемы могут быть решены с помощью длинных ридов, получаемых на MinION. Длинные риды MinION дают возможность получения длинных контигов, но в них будут ошибки и требуется процедура, называемая polishing, или отладка — уточнение последовательности, как правило, с помощью специального ПО. Наиболее это выражено, когда библиотеки Illumina отличаются одна от другой, например, в случае ДНК с разным GC-составом. Протяжённые контиги важны для идентификации длинных вставок и кластеров генов, ответственных за биосинтез вторичных метаболитов. Только с помощью длинных ридов можно однозначно интерпретировать подобные кластеры, богатые повторами.

Подводя итоги, можно сказать, что сборка генома из коротких ридов осложнена в случае повторов и GC-богатых структур. Результаты данной работы показывают, что эти сложности могут быть преодолены с помощью длинных ридов, получаемых при нанопоровом секвенировании. Таким образом, собранные из длинных ридов последовательности затем подвергаются отладке с помощью данных секвенирования на Illumina. Cочетание двух технологий секвенирования — Illumina и Oxford Nanopore — наиболее эффективно для секвенирования при изучении эволюции микроорганизмов.

Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing.
Sarah Goldstein, Lidia Beka, Joerg Graf, View ORCID ProfileJonathan Klassen.
_____________________________________________________________________________________________________

Использование MinION для исследования динамических структур в плазмидах у Salmonella, ответственных за мультилекарственную устойчивость
10.08.2018

ISCR1 — мобильный генетический элемент, ответственный за передачу генов устойчивости к антибиотикам. Генетическое разнообразие распределения и копийности ISCR1 в популяции бактерий, отражающее степень генетической пластичности, пока не изучено. Целью данного исследования было изучение плазмидной гетерогенности у Salmonella, используя ISCR1. Для выявления структур, несущих разное количество копий ISCR1-qnrB6, применялось нанопоровое секвенирование, а также другие технологии секвенирования.

Штамм Salmonella London Sa128 оказался позитивным по ISCR1-qnrB6 и обладал конъюгативной IncF-плазмидой pSa128, которая содержит интегрон 1 класса и ответственна за мультилекарственную устойчивость. Плазмида pSa128T из трансконъюганта длиннее по сравнению с оригинальной плазмидой pSa128, вероятно, из-за амплификации элемента ISCR1-qnrB6. Длинные риды, полученные с помощью нанопорового секвенирования, показали, что обе плазмиды из донора и трансконъюганта гетерогенны и содержат разное количество копий ISCR1-qnrB6 — 4 или 8. Подобная плазмидная гетерогенность в одном шатмме может рассматриваться как атипичный плазмидом.

Данная работа показала важность исследования нуклеотидной последовательности отдельных плазмид с помощью нанопорового секвенирования при изучении сложной структуры генов мультилекарственной устойчивости. Получаемые длинные риды позволяют выявлять плазмидную гетерогенность и полиморфизмы в этих генах среди представителей одного и того же штамма.

Resolution of dynamic MDR structures among the plasmidome of Salmonella using MinION single-molecule, long-read sequencing.
Ruichao Li Kaichao Chen Edward Wai Chi Chan Sheng Chen.
_____________________________________________________________________________________________________



Изучение вирулентности и мультилекарственной устойчивости у Mycobacterium tuberculosis
10.08.2018

Каждый год регистрируется более 10 млн. случаев заболевания туберкулёзом, 600 тысяч из которых вызываются штаммами Mycobacterium tuberculosis, устойчивыми к лекарствам, таким как рифампицин или изониазид. Но большую опасность представляют штаммы с устойчивостью широкого спектра (XDR-штаммы). Механизм этой устойчивости и её передачи изучен недостаточно. Для его исследования используются методы секвенирования коротких ридов, которые не дают возможность анализа структурных вариаций, повторов и увеличения числа копий генов. Как правило, именно эти генетические особенности ответственны за вирулентность и передачу лекарственной устойчивости.

Учёные из Квинслендского университета (Австралия) использовали длинные риды, полученные с помощью нанопорового секвенирования, для исследования эволюционных механизмов, связанных с возникновением устойчивых штаммов M.tuberculosis. Было проведено т.н. секвенирование «методом дробовика» (шотган-секвенирование) XDR-штамма M.tuberculosis, ответственного за устойчивую к лекарствам эпидемию туберкулёза в западных областях Папуа-Новой Гвинеи. Для сборки генома использовалось ПО CANU, для отладки — ПО Racon. Была собрана полная последовательность кольцевого генома M.tuberculosis с 273-кратным покрытием и точностью 99,95%. Были идентифицированы все точечные полиморфизмы, связанные с лекарственной устойчивостью. Выявлены мутации в генах системы активного выведения, мембранного транспорта, биосинтеза клеточной стенки и вирулентности, которые могут фенотипически проявляться в лекарственной устойчивости M.tuberculosis и её передаче. Стоит отметить точное секвенирование GC-богатых областей и областей с повторами Pro-Glu и Pro-Pro-Glu. Именно такие области находятся в генах, связанных с вирулентностью и подавлением иммунитета.

Ряд исследованных генов ранее не был представлен в последовательностях ДНК M.tuberculosis, полученных с помощью коротких ридов — из-за большого количества GC или из-за делеций со сдвигом рамки считывания. Выявлены 2 области, отсутствующие в геномах европейских и американских штаммов.

https://nanoporetech.com/resource-centre/characterising-virulence-and-amr-mycobacterium-tuberculosis
_____________________________________________________________________________________________________

Быстрое секвенирование плазмид и выявление генов лекарственной устойчивости
10.08.2018

Большинство генов лекарственной устойчивости (устойчивости к антибиотикам) у бактерий находится в плазмидах. Однако традиционные технологии секвенирования недостаточно применимы из-за большого количества повторов в плазмидной ДНК.

Бактериальные плазмиды могут быть длиной до 100 тыс.п.н., что приводит к определённым проблемам при сборке в случае коротких ридов. Например, сложно дифференцировать геномную и плазмидную ДНК. А определение локализации генов антибиотикоустойчивости позволяет проводить эпидемиологические и эволюционные исследования и выявлять механизмы передачи устойчивости.

Исследователи из Национального института здравоохранения (США) использовали нанопоровое секвенирование для анализа плазмидной последовательности с целью быстрого выявления антибиотикоустойчивости. Сначала была секвенирована плазмида из хорошо изученного карбапенем-устойчивого изолята Klebsiella pneumoniae. Для приготовления библиотеки использовали набор на основе лигирования Oxford Nanopore. Сборка длинных ридов дала консенсусную последовательность с точностью 99%. После отладки (polishing) последовательности с помощью коротких ридов точность достигла 99,9%, однако для потенциального применения методики в клинической практике надо ограничиваться только нанопоровым секвенированием для сокращения времени исследования.

Все три плазмиды из изолята были отсеквенированы на 98%, все гены антибиотикоустойчивости идентифицированы. Чтобы ещё сократить время анализа, плазмидная ДНК из другого изолята Klebsiella pneumoniae была секвенирована с помощью набора для пробоподготовки на основе транспозазы Oxford Nanopore.

Данная стратегия позволяет идентифицировать все гены лекарственной устойчивости в микроорганизме менее чем за 6 часов. Достаточное покрытие для сборки генов антибиотикоустойчивости может быть получена с помощью 2000-5000 ридов, генерируемых за 20 минут.

Применение нанопорового секвенирования для построения профиля лекарственной устойчивости было также продемонстрировано учёными из Исследовательского института в Шеньжене (Китай). Они использовали бар-кодирование для мультиплексного секвенирования 12 штаммов бактерий с мультилекарственной устойчивостью. За 8 часов были получены риды, достаточные для полной сборки 20 плазмид (+ одна практически полная). Более того, одна плазмида длиной более 90 тыс. п.н. была секвенирована за одно прочтение и не требовала дальнейшей сборки. По результатам исследования получилось, что на одной проточной ячейке нанопорового секвенатора можно провести три запуска — 8, 10 и 12 часов. В сочетании с бар-кодированием это даёт возможность анализа 36 образцов на одной ячейке, что существенно снижает стоимость секвенирования плазмидной ДНК.

https://nanoporetech.com/resource-centre/rapid-sequencing-plasmids-and-resistance-gene-detection
_____________________________________________________________________________________________________

Понимание эволюционирования геномов ДНК-содержащих вирусов
10.08.2018

Учёные из университета штата Юта (США) использовали нанопоровое секвенирование для полногеномного анализа ДНК-содержащих вирусов с целью понимания эволюционных механизмов, помогающих вирусам в конфликте «хозяин-патоген». Как и другие вирусы с двунитевой ДНК, Orthopoxvirus vaccinia способен к быстрой адаптации несмотря на достаточно низкую скорость точечных мутаций (по сравнению с вирусами, содержащими однонитевую ДНК или РНК-вирусами). Ранее идентифицированы два белка — E3L и K3L, ингибирующие иммунный ответ хозяина. Делеция гена E3L и последующие пассажи вируса на культуре человеческих клеток приводят к появлению тандемных повторов из гена K3L. Также в гене K3L у вирусов с делецией E3L возникает точечная мутация H47R, приводящая к повышенной патогенности.

Технологии секвенирования, дающие короткие риды, позволяют идентифицировать эту точечную мутацию и секвенировать в целом локус K3L, но не дают возможность генотипировать полиморфизмы в тандемных повторах или охарактеризовать число копий гена. Технология нанопорового секвенирования позволяет охватить всю область генома, включающую повторы K3L. С её помощью выяснено, что число копий гена стабилизируется после 10 пассажа (до 15 копий), а полиморфизм H47R накапливается между 10 и 20 пассажами.

Предположено, что у вирусов с двунитевой ДНК имеет место накопление благоприятных мутаций за счёт их повторения в нескольких копиях генов.

https://nanoporetech.com/resource-centre/understanding-evolution-large-dna-viruses
_____________________________________________________________________________________________________



Быстрое секвенирование геномов РНК-содержащих вирусов
10.08.2018

Энтеровирусы относятся к группе вирусов, содержащих 1-нитевую РНК, и являются причиной миллионов случаев инфекций каждый год по всему земному шару. Для идентификации энтеровирусов в клинической практике наиболее часто используется ПЦР. Однако точечные мутации и рекомбинации у этих вирусрв встречаются очень часто и могут привести к ложнонегативным результатам ПЦР. Кроме того, данная техника требует культивирования вируса в течение 5-10 дней, что может быть критичным.

Группа учёных из Бернского университета (Швейцария) использовала прямое секвенирование РНК с помощью нанопоровой технологии для получения полной последовательности генома энтеровирусов из клинических образцов. С помощью вирусной кДНК из культуральных образцов можно получить консенсусную последовательность с точностью 98,8% уже через несколько минут после запуска секвенирования. Отладка последовательности с помощью программы Nanopolish повышает точность до 99,8%.

Прямое секвенирование РНК не требует обратной транскрипции и полезно в случаях, когда время является критическим фактором, например, при идентификации патогенов в клинической практике. Метод, разработанный исследователями из Бернского университета, позволяет получить результат с помощью прямого секвенирования РНК за 5 с половиной часов по сравнению с методом, включающим в себя обратную транскрипцию.

Прямое секвенирование РНК позволяет работать с клиническим материалом (стул), минуя стадию культивирования вируса. Хотя стандартная методика секвенирования рассчитана на 400 нг исходной РНК, удалось получить полную сборку генома вируса Коксаки со 140 нг стартового материала. Сборка была осуществлена на базе 11 ридов по 1000 нуклеотидов и более. В дальнейшем удалось получить практически полногеномную последовательность длиной 7208 нуклеотидов за 1 прочтение (не удалось прочитать 25 и 109 нуклеотидов на 5’- и 3’-концах, соответственно).

Таким образом, прямое секвенирование РНК даёт возможность быстро получить последовательность вирусного генома и избежать ошибок, связанных со стадиями обратной транскрипции и ПЦР.

https://nanoporetech.com/resource-centre/rapid-sequencing-rna-virus-genomes
_____________________________________________________________________________________________________

Сборка генома de novo и выявление лекарственной резистентности человеческого вируса герпес 1 типа (HHV-1)
10.08.2018

От 60 до 90% человеческой популяции инфицировано вирусом герпеса 1 типа. Для лечения герпеса существует множество препаратов, но ко всем из них у вируса имеются мутации, приводящие к устойчивости. HHV-1 содержит 2-нитевую ДНК длиной 152 тыс п.н., обладающую сложной структурой и богатую GC-областями. Это делает затруднительной сборку вирусного генома из коротких ридов.

Для изучения генома герпесвируса исследователи из Оксфордского университета (Великобритания) использовали как длинные риды, полученные с помощью нанопорового секвенирования, так и короткие. Было секвенировано 18 образцов, полученных от пациентов после антивирусной терапии. Сборка геномов производилась с помощью MIRA48 и LINKS49. Длина ридов, полученных при нанопоровом секвенировании, позволила объединить контиги, полученные из коротких ридов и прерываемые повторяющимися элементами. Таким образом, сборка осуществлялась из меньшего числа контигов большей длины.

Были охарактеризованы области генома герпесвируса со структурными вариациями — повторами, делециями и перестановками. Максимальный уровень нуклеотидных вариаций, связанных с лекарственной устойчивостью, обнаружен в гене UL23. Вероятно, эти мутации возникают в ходе терапии.

https://nanoporetech.com/resource-centre/de-novo-assembly-and-characterisation-drug-resistance-human...