Особенности применения готовых полиакриламидных гелей Bolt Bis-Tris Plus, Thermo FS. Обзор

Электрофорез в полиакриламидном геле применяется для качественной идентификации белков в молекулярной биологии и протеомике, а так же для контроля качества и чистоты биофармацевтических препаратов. Качество разделения биомолекул в геле, как правило, зависит от таких факторов, как качество заливки геля, правильного выбора процентного содержания и состава геля.

Готовые или самодельные гели?

Заливка геля – процесс рутинный, требующий наличия некоторого опыта и не терпящий спешки. Использование готовых (заводских) акриламидных гелей для электрофореза (SDS -Page) – это не только верный способ сэкономить время, затрачиваемое на заливку геля, но и увеличить воспроизводимость результатов электрофореза. На сегодняшний день производители предлагают довольно большой выбор залитых (прекастированных) гелей, позволяющих стандартизовать процедуру электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE).

Что выбрать: бис-трис или трис-глициновые гели?

Чаще всего, для разделения широкого спектра белков с помощью ПААГ используются гели по Лэммли с трис-глицином. Такие гели содержат компонент, который помогает фокусировать белки в полосы в начале электрофоретического цикла. Так же эти гели имеют компонент, разделяющий белки по размеру. В этой классической системе используется прерывистая буферная система геля, в которой pH и ионная сила буфера, используемого для прогона геля (Tris, pH 8,3), отличаются от буферов, используемых в накопительном геле (Tris, pH 6,8) и разделяющем геле (Tris, pH 8,8).

Основные причины плохого разрешения полосы в системе Лэммли:

Недостатком гелей по Лэммли является завышенный щелочной рабочий диапазон pH, что может вызвать искажение полос, потерю разрешения геля и появление искажений на полосах:

• гидролиз полиакриламида при высоком pH разрешающего геля, в результате чего срок хранения составляет не более 8 недель;
• химические изменения образца (дезаминирование и алкилирование белков), из-за высокого pH разделяющего геля;
• повторное окисление восстановленных дисульфидов из цистеинсодержащих белков, так как окислительно-восстановительное состояние геля непостоянно;
• расщепление Asp-Pro связей белков при нагревании до 100 °C в буфере для образцов Лэммли, pH 5,2.

В отличие от традиционных гелей с трис-глицином, бис-трис гели забуферены Bis-Tris HCl (с pH 6,4) и имеют рабочий диапазон pH около 7,0. Именно нейтральный рабочий pH систем Бис-Трис обеспечивает преимущества по сравнению с системой Лэммли:

• более длительный срок хранения за счет повышенной стабильности геля;
• повышенная стабильность белка во время электрофореза, что обеспечивает более четкое разрешение полосы и точные результаты;
• полное восстановление дисульфидов при умеренном нагревании (+70 ° C в течение 10 минут) и отсутствие разрыва связей Asp-Pro.

Как правильно выбрать процентное содержание геля?

Как правило, размер разделяемой молекулы должен определять процентное содержание акриламида или агарозы, которое вы выбираете. Использование гелей с низким процентным значением, позволяет эффективно разделять более крупные молекулы. И наоборот: более высокое процентное содержание геля предназначено для разгонки более мелких биомолекул. Исключением из этого правила является проведение изоэлектрического фокусирования.

Для корректного выбора процентного содержания геля, наиболее подходящий для вашего применения, предлагаем Вам использовать диаграммаму молекул того или иного размера в гелях. Обращаем Ваше внимание, что для получения наилучшего разрешения, как правило, молекулы должны пройти не менее 70% длины геля. В случаях, когда молекулярные массы белков широко варьируются или неизвестны, лучшим выбором.

Уникальная конструкция клиновидной лунки позволяет загружать в 2 раза больший объем образца, чем другие готовые гели. Гели Bolt идеальны для переноса и анализа методом вестерн-блоттинга наряду с любыми другими методами, в которых целостность белка имеет решающее значение.

Особенности гелей Bolt Bis-Tris Plus:

• оптимизированные и ускоренные условия разгона (разделение белков при постоянном напряжении за 35 минут);
• длительный срок хранения (не менее 16 месяцев при температуре 4–25 °C);
• максимальная целостность белка благодаря нейтральному значению pH геля;
• лунки клиновидной формы для упрощения загрузки образцов и увеличения объема образца;
• высокая воспроизводимость от партии к партии (коэффициент вариации (CV) всего 2%);
• диапазон разделения (в зависимости от концентрации геля), кДа – от 0,3 до 260;
• концентрации геля: 8%, 10% и 12% или градиент 4–12%;
• размеры геля, см – 8 x 8;
• толщина геля, мм – 1.