Определение плоидности клеток растений методом проточной цитометрии. Обзор

07.02.2022

На протяжении многих лет плоидность оценивали с помощью различных методов, но в настоящее время наиболее часто используемым методом становится проточная цитометрия (ПЦ). Проточная цитометрия – высокопроизводительный, точный и чувствительный метод, позволяющий сравнивать растения с разным размером генома, а также определять абсолютное содержание ДНК, используя контрольные образцы. Популярность проточной цитометрии заключается в простоте пробоподготовки, и возможности за короткое время проанализировать ядра нескольких тысяч клеток, обеспечивая высокую скорость анализа, точность и статистическую достоверность. Анализ ДНК в ядрах клеток дает информацию о плоидности организма и представляет большую ценность для потенциального увеличения урожайности с применением биотехнологий в современном сельском хозяйстве. Данные исследования проводятся с использованием такого оборудования как цитометры и сортеры.

Пробоподготовка растительной ткани

Подготовка образца для измерения простая: ядра выделяются при тщательном измельчении образца в буфере лезвием бритвы (рис.1 Б), далее гомогенат фильтруют через мембрану (рис. 1 В), ядра окрашиваются ДНК-связывающим флуоресцентным красителем (рис. 1 Г) и измеряются на «классическом» проточном цитометре или клеточном сортере (рис. 1 Д). Ядра обычно выделяют из свежих листьев, но также пригодны для выделения сухие семена, высушенные или замороженные ткани и даже пыльца. Автоматизация выделения, одновременное измельчение большого количества проб может достигаться путем применения гомогенизатора (рис. 1 Д).

Рис. 1. Пробоподготовка растительной такни для последующего изучения на проточном цитометре и/или сортере.

Получение результата

Интенсивность флуоресценции окрашенных ядер, то есть относительное содержание ДНК, может быть переведено в абсолютное значение при сравнении с образцом с известным размером генома (экспериментальный и контрольный образцы измельчаются, окрашиваются одновременно с испитуемим образцом). Результат измерения это гистограмма (Рис. 2, 3, 4) распределения флуоресцентного сигнала, где каждый пик характеризует ядра со схожим количеством ДНК, чем выше уровень плоидности, тем правее расположение пика. Для каждого пика подсчитывается среднее значение флуоресценции, которое выражается как коэффициент вариации (CV), используемые для характеристики уровня плоидности и статистической достоверности измерения. В результате, для каждого ядра подсчитывается значение интенсивности флуоресценции, которая пропорциональна количеству связанного с ДНК красителем, то есть содержанию ДНК в ядре. В результате, для каждого ядра подсчитывается значение интенсивности флуоресценции, которая пропорциональна количеству связанного с ДНК красителем, то есть содержанию ДНК в ядре.

Наложение гистограмм флуоресценции ядер из листьев резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana), полученных при разных скоростях потока на проточном цитометре с акустической фокусировкой Attune NxT.

Распределение пиков флуоресценции у гибридных сортов капусты огородной Brassica oleracea с разным числом хромосом (18,19,20 – число хромосом в каждом из гибридных сортов).

Рис. 2. Наложение гистограмм флуоресценции ядер из листьев резуховидки Таля (Arabidopsis thaliana), полученных при разных скоростях потока на проточном цитометре с акустической фокусировкой Attune NxT. Схожая ширина пиков отражает стабильность.

Рис. 3. Распределение пиков флуоресценции у гибридных сортов капусты огородной Brassica oleracea с разным числом хромосом (18,19,20 – число хромосом в каждом из гибридных сортов).

Типичные гистограммы характерные для диплоидных-2С (А) и тетраплоидных-С4 (В) форм растения R. acetosa in vitro получены методом проточной цитометрии

Рис. 4. Типичные гистограммы характерные для диплоидных-2С (А) и тетраплоидных-С4 (В) форм растения R. acetosa in vitro получены методом проточной цитометрии.

Также с использованием проточного цитометра Attune NxT, (Thermo FS) возможно:

эффективно определить фазы клеточного цикла растительных клеток;
идентифицировать межвидовые гибриды от скрещивания различных видов с одинаковым числом хромосом с мелкохромосомными видами;
детектировать анеуплоидию.

После проведения цитометрии и сортинга отобранные растительные клетки можно использовать для исследования клеточного метаболизма, генной экспрессии, претеомного анализа и др.

Литература

1) Коломиец О. О., Павлова И. В., Глушен С. В. Цитометрический анализ плоидности и пролиферации клеток у растущих in vitro линий овощных культур // Генетика. – 2015. – Т. 10. – С. 116.
2) Pellicer J., Leitch I. J. The application of flow cytometry for estimating genome size and ploidy level in plants //Molecular plant taxonomy. – Humana Press, Totowa, NJ, 2014. – С. 279-307.
3) David Galbraith, Elizabeth Villalobos. Analysis of plant genome sizes using flow cytometry: a case study demonstrating dynamic range and measurement linearity // Menuey School of Plant Sciences and Bio5 Institute.
4) Antoniadi I. et al. Fluorescence activated cell sorting—A selective tool for plant cell isolation and analysis //Cytometry Part A. – 2021.
5) Зубко О.Н., Соколов В.О., Шумеев А.Н., Ирхин С.Ю. Определение плоидности методом проточной цитометрии в селекции F1-гибридов Brassica// Всероссийский Съезд по защите растений.