ИПТГ (изопропил-бета-галактопиранозид) по спеццене

ИПТГ, или изопропил-бета-галактопиранозид — реагент, используемый в молекулярной биологии, в первую очередь — в генной инженерии. ИПТГ — это молекулярный аналог аллолактозы, являющейся индуктором транскрипции генов под контролем lac-оперона. Но, в отличие от аллолактозы ИПТГ не гидролизуется бета-галактозидазой, поэтому его концентрация остаётся постоянной. Это важно при культивировании микроорганизмов-продуцентов рекомбинантных белков, поскольку не требуется регулярное внесение индуктора в культуру, достаточно сделать это один раз.

ИПТГ связывается с lac-репрессором (lacI) — белком, блокирующим транскрипцию генов, ответственных за метаболизм лактозы. В бактериальных клетках дикого типа это, в первую очередь, ген бета-галактозидазы (lacZ). В генной инженерии широко применяется метод клонирования, при котором чужеродный ген встраивается в вектор под контроль lac-промотора, а затем эта конструкция трансформируется в клетки E.coli. Таким образом, экспрессия этого гена контролируется lac-репрессором и активируется с помощью ИПТГ. Это важно, например, в тех случаях, когда кодируемый чужеродным геном белок оказывает негативное воздействие на бактериальную клетку и его трансляция на стадии лаг-фазы нежелательна.

Ещё одна особенность ИПТГ заключается в том, что его проникновение в клетку не зависит от активности галактопермеазы — белка-транспортера лактозы, ген которого (lacY) также находится под контролем lac-оперона. Также ИПТГ используется в генной инженерии при проведении бело-голубой селекции. Метод бело-голубой селекции применяется при трансформации для быстрой идентификации колоний бактерий, содержащих вектор с генно-инженерной конструкцией. Рост трансформантов осуществляется в присутствии ИПТГ и X-gal — аналога лактозы, дающего при расщеплении бета-галактозидазой метаболит синего цвета. Клонирование чужеродного гена в вектор происходит внутрь гена бета-галактозидазы, поэтому бактерии, трансформированные вектором со вставкой, не способны расщеплять X-gal. Таким образом, клоны, содержащие вектор со вставкой, образуют на LB-агаре колонии белого цвета, а клоны без вставки — колонии синего цвета. Стандартная концентрация ИПТГ для бело-голубой селекции 1 мМ. Для индукции экспрессии рекомбинантных белков используют концентрации от 0,1 до 0,5 мМ, но для штаммов E.coli BL21 и BL21(DE) с повышенной продукцией lac-репрессора, применяемых для препаративного получения рекомбинантных белков, рекомендуется более высокая концентрация. X-gal, или 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид — хромогенный субстрат для фермента бета-галактозидазы. При расщеплении бета-галактозидазой от субстрата отщепляется индольная структура, которая спонтанно окисляется и выпадает в виде осадка синего цвета. Это свойство широко используется в молекулярной и клеточной биологии. В первую очередь, X-gal применяется для анализа активности репортерного гена lacZ, кодирующего бета-галактозидазу, в клетках бактерий, дрожжей и животных. В растениях в качестве репортерного гена, маркером активности которого также является X-gal, используется ген GUS. Также X-gal используется совместно с конъюгатами гликозидаз в качестве реагента для вторичной детекции при иммуногистохимии и ELISA. Наконец, поскольку бета-галактозидаза сохраняет свою активность в фиксированных клетках и тканях, X-gal используется для детекции её активности.

А также: