Нанопоровое секвенирование Oxford Nanopore

19.12.2018

Нанопоровое секвенирование (Nanopore sequencing) хотя и относится формально к NGS (секвенированию нового поколения), но фактически представляет собой следующий этап развития технологии секвенирования нуклеиновых кислот.

Все предыдущие технологии основаны на непрямом определении последовательности, то есть включают в себя стадию синтеза на ДНК-матрице, в процессе которого происходит детекция встраиваемых нуклеотидов-мономеров. При этом процесс секвенирования включает стадию пробоподготовки (ПЦР, мечение образца и т.д.).

При нанопоровом секвенировании происходит чтение нуклеотидного состава непосредственно анализируемой молекулы, что приводит к упрощению процесса, уменьшению временных затрат (в первую очередь, на анализ результатов) и снижению его стоимости. Принцип нанопорового секвенирования заключается в перемещении анализируемой молекулы через нанопору и регистрации изменения в окружающем электрическом поле в процессе движения молекулы.

В настоящий момент для секвенирования используются нанопоровые структуры биологического происхождения, но при этом разрабатываются искусственные нанопоры на основе диоксида кремния, а также гибридные молекулы.

Только Oxford Nanopore может это:

прямое чтение нуклеотидной последовательности цепей ДНК, РНК;
длина прочтения ограничена только длиной фрагмента;
наблюдение за ходом секвенирования в реальном времени дает возможность остановки процесса в любой момент при достаточном накоплении данных, при очевидных ошибках пробоподготовки или других сбоях в работе; интерпретацию сигналов (basecalling) и анализ данных можно проводить непосредственно в процессе секвенирования; простой алгоритм сборки полученных буквенных последовательностей;
секвенирование в полевых условиях и в мобильных лабораториях — нет необходимости доставлять образцы в специализированную лабораторию;
простая и быстрая подготовка библиотек — в течение 10 минут за 2 шага;
оборудование не требует специальных навыков для инсталляции и обслуживания.

В мае 2015 года компания Oxford Nanopore Technologies выпустила на рынок коммерческий секвенатор на основе нанопоровой технологии — MinION. Он представляет собой устройство карманного формата, подключаемое к USB-порту компьютера. В основе прибора — ячейка с 512 нанопорами, позволяющая провести одновременное секвенирование до 512 молекул ДНК или РНК (10-20 Гб информации). Длина прочтения может составлять до сотен тысяч пар нуклеотидов, а процесс пробоподготовки длится около 10 минут (с помощью набора Rapid Sequencing Kit). Сейчас на рынке доступны три секвенатора разной производительности.


MinION карманный секвенатор Одна проточная ячейка До 20 Гб данных Подключается в ПК через USB 3.0 Многоразовая проточная ячейка, рассчитанная на 48 часов непрерывной работы — 512 каналов с нанопорами	GridlON настольный секвенатор 5 проточных ячеек — 2560 активных каналов с нанопорами До 100 Гб данных Независимая работа каждой ячейки Встроенный компьютер	PromethION высокопроизводительный секвенатор 48 проточных ячеек — 144 000 активных каналов с нанопорами Для анализа больших массивов данных Независимая работа каждой ячейки Отдельно стоящий компьютер в комплекте

Другое оборудование Oxford Nanopore Technologies

Flongle — адаптер для MinION и GridION, позволяет работать с одноразовыми ячейками, применяется для задач, где требуется прямое прочтение более коротких ридов в режиме онлайн, — 128 каналов с нанопорами; для контроля качества, секвенирования ампликонов, малых геномов, таргетного секвенирования.

MinIT — карманный компьютер с предустановленными Linux OS и MinKNOW, предназначен для работы с секвенатором MinION как дополнение или альтернатива персональному компьютеру. Процесс также может контролироваться через bluetooth с ноутбука, планшета или смартфона.

VolTRAX v.2 — портативный прибор для автоматической подготовки библиотек.

Встроенный нагревательный блок и магниты;
наличие элемента Пельтье, позволяющего нагрев до +98 °С, и, следовательно, постановку полноценной ПЦР;
15 загрузочных портов (в отличие от 8 у предыдущей версии прибора), что позволяет работу с любым набором для пробопоготовки;
усовершенствованный механизм перемешивания;
встроенный детектор флуоресценции для количественного анализа нуклеиновых кислот;
минимальные затраты на расходные материалы и реагенты;
подготовка библиотек вне лаборатории;
работа от ПК через USB.

SmidgION — разрабатываемое в данный момент устройство для секвенирования, подключаемое к смартфону или другому мобильному устройству. Предназначено для работы в полевых условиях.

Наборы для подготовки библиотек ДНК без стадии ПЦР:

#LSK108 Набор Ligation Sequencing Kit 1D, 6 реакций. Для наибольшей производительности, пробоподготовка 60 мин, 1000 нг дцДНК, фрагментация опционально, длина рида равна длине фрагментов ДНК.

#RAD004 Набор Rapid Sequencing Kit, 6 реакций. Простая и быстрая пробоподготовка, 10 мин, 400 нг высокомолекулярной геномной ДНК (> 30 т. п.о.), фрагментация транспозазой, длина фрагмента случайная.

#LSK308 Набор 1D2 Sequencing Kit, 6 реакций. Наибольшая точность прочтения, пробоподготовка 80 мин, 1000 нг ДНК, фрагментация опционально, длина рида равна длине фрагментов ДНК, чтение обеих цепей двухцепочной ДНК.

Наборы для подготовки библиотек РНК:

#RNA001 Набор Direct RNA Seqeuncing Kit, 3 реакции. Прямое секвенирование молекул РНК с сохранением модификаций оснований, пробоподготовка 115 мин, 500 нг РНК (поли А+), длина рида равна длине фрагментов РНК, без стадии ПЦР, обратная транскрипция опционально.

#PCS108 Набор cDNA-PCR Sequencing Kit, 6 реакций. Секвенирование полноразмерных транскриптов с высокой производимостью, пробоподготовка 115 мин, 50 нг РНК (поли А+), длина рида преимущественно равна длине полноразмерных кДНК, со стадией ПЦР и обратной транскрипцией.

#DCS108 Набор Direct cDNA Sequencing Kit, 6 реакций. Секвенирование полноразмерных транскриптов без стадии ПЦР, пробоподготовка 210 мин, 250 нг РНК (поли А+), длина рида равна длине фрагментов кДНК, без стадии ПЦР, с обратной транскрипцией.

Другие наборы для подготовки библиотек:

наборы, включающие стадию ПЦР, при небольших количествах выделенной ДНК;
наборы для мультиплексирования, для снижения затрат на секвенирование (баркодирование);
наборы для специфических применений — анализ 16S, устойчивость к антибиотикам, идентификации бактерий, грибов, архей, вирусов, секвенирование экзома;
наборы для баркодирования.

Basecalling и интерпретация данных

При прохождении молекулы нуклеиновой кислоты через нанопору регистрируются данные об изменении электрического тока, на основании этих данных можно интерпретировать не только последовательность нуклеотидов, но и их различные модификации. Интерпретация (Basecalling) может происходить онлайн с помощью встроенной программы MinKNOW или оффлайн с программой Albacore. Платформа EPI2ME — готовое решение от подготовки библиотек до получения результата для некоторых применений (баркодирование, анализ 16S, устойчивость к антибиотикам, идентификации бактерий, грибов, архей, вирусов (WIMP – What is in my pot), секвенирование экзома, сопоставление полученных сиквенсов с имеющимися в базах данных (GenBank). В Nanopore Community доступны различные решения для анализа полученных данных — Variant calling, de novo assembly и многое другое. Данные, полученные в процессе секвенирования, записываются в виде файлов в формате fast5 или fastq и пригодны для анализа с помощью инструментов в Nanopore Community или платформы EPI2ME.

Также компания Стар-лаб предлагает секвенаторы: