Секвенирование нанопоровое

Набор предназначен для быстрого и простого получения сиквенсной библиотеки, включающей до 12 различных образцов ДНК. С помощью набора Rapid Barcoding Kit можно:

• объединять несколько образцов ДНК в одну библиотеку;
• свести время пробоподготовки к минимуму;
• идентифицировать модификации нуклеотидов, так как пробоподготовка проходит без ПЦР;
• использовать минимум лабораторного оборудования.

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 10 минут
требуемое количество ДНК	400 нг высокомолекулярной геномной ДНК
необходимость ПЦР	нет
фрагментация ДНК	транспозазная
длина рида	случайная, зависит от длины исходных фрагментов
производительность	1-2 гигабазы за 6 часов, 4-8 гигабаз за 48 часов
совместимые протоколы	Rapid Barcoding Sequencing*
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	R9.4.1; R10

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор предназначен для исследований, требующих простой пробоподготовки и быстрого результата, но не максимальной производительности секвенирования. Так как количество стадий пипетирования и время подготовки минимальны, набор даёт возможность получения длинных ридов, но макcимальная длина зависит от качества исходной ДНК. Поэтому для лучшего результата рекомендуется использовать ДНК со средней длиной фрагментов не менее 30 гигабаз. Для выделения высокомолекулярной геномной ДНК можно использовать набор Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (Qiagen).

Пробоподготовка заключается в расщеплении ДНК транспозазой и присоединении к фрагментам бар-кодов. Баркодированные фрагменты ДНК объединяются, и к ним присоединяются сиквенсные адаптеры.

Рекомендуемое исходное количество ДНК — не менее 400 нг. Возможно получение библиотеки из меньшего количества ДНК, а также из фрагментированной ДНК, но производительность будет ниже. Для получения библиотеки из меньших количеств ДНК рекомендуется набор PCR Sequencing Kit и протоколы Low Input и Rapid Low Input*.

Так как при получении библиотеки отсутствует стадия ПЦР, данный набор пригоден для выявления модифицированных нуклеотидов.

Сортировка ридов в соответствии с баркодами производится с помощью программных инструментов, доступных в рамках платформы EPI2ME.

В состав Rapid Barcoding Kit также входит набор Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотеки в поточную ячейку.

Сиквенсные адаптеры RAP, входящие в набор, также могут быть приобретены в виде отдельного набора EXP-RAP001.

Условия хранения: -20 °С.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 003010851);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Thermo FS AB0620);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo FS R0581).

Опционально:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);с
• свежеприготовленный 70% этанол;
• буферный раствор Tрис-HCl 10 мМ рН 8.0 с 50 мМ NaCl.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• амплификатор;
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit (Thermo FS Q33227) или аналогичный;
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L).

Набор предназначен для быстрого и простого получения сиквенсной библиотеки, включающей до 12 различных образцов ДНК, в тех случаях, когда количество ДНК

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 15 минут + ПЦР
требуемое количество ДНК	1-5 нг геномной ДНК
необходимость ПЦР	Да
фрагментация ДНК	транспозазная
длина рида	около 2 килобаз
производительность	1-2 гигабазы за 6 часов, 4-8 гигабаз за 48 часов
совместимые протоколы	Rapid PCR Barcoding Sequencing*
количество библиотек	6

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор предназначен для исследований, требующих простой пробоподготовки и быстрого результата, но не максимальной производительности секвенирования.

Пробоподготовка заключается в расщеплении ДНК транспозазой и присоединении к фрагментам олигонуклеотидов, содержащих сайты связывания ПЦР-праймеров. Затем каждый образец ДНК амплифицируется с помощью баркодированных праймеров. Баркодированные ампликоны объединяются, и к ним присоединяются сиквенсные адаптеры.

Длина ампликонов в среднем составляет около 2 килобаз и не зависит от длины исходной ДНК. Это связано в большей степени с особенностями пробоподготовки, а не с процессивностью Taq-полимеразы.

Поэтому для пользователей, работающих с малым исходным количеством геномной ДНК и желающих получить риды максимальной длины, рекомендуется набор Ligation Sequencing Kit и протокол Low input genomic DNA with PCR.

Набор позволяет работать с ДНК, содержащей примеси, которые снижают эффективность получения библиотеки. Это происходит благодаря стадии ПЦР. Но необходимо учитывать, что амплификация разных фрагментов может идти с разной эффективностью.

Если исходное количество ДНК менее 1 пг, рекомендуется полногеномная амплификация.

Сортировка ридов в соответствии с баркодами производится с помощью программных инструментов, доступных в рамках платформы EPI2ME.

В состав Rapid PCR Barcoding Kit также входит набор Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотеки в поточную ячейку.

Условия хранения: -20 °С.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Thermo FS AB0620);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo FS R0581);
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2X (New England Biolabs M0287);
• свежеприготовленный 70% этанол;
• буферный раствор Tрис-HCl 10 мМ рН 8.0 с 50 мМ NaCl.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор;
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit (Thermo FS Q33227) или аналогичный;
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).

Набор предназначен для быстрого получения библиотеки из геномной ДНК с помощью простого 2-шагового протокола, пробоподготовка занимает не более 10 минут. Процесс основан на транспозазном расщеплении ДНК с последующей пришивкой сиквенсных адаптеров.

Особенности набора:

время пробоподготовки	10 минут
требуемое количество ДНК	400 нг высокомолекулярной ДНК
необходимость ПЦР	нет
фрагментация ДНК	транспозазная
длина рида	случайная, зависит от длины исходных фрагментов
производительность	1-2 гигабаз за 6 часов, 4-8 гигабаз за 48 часов
совместимые протоколы	Rapid Sequencing; Rapid whole genome amplification
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-MIN107

Набор предназначен для исследований, требующих простой пробоподготовки и быстрого результата, но не максимальной производительности секвенирования. Так как количество стадий пипетирования и время подготовки минимальны, набор даёт возможность получения длинных ридов, но макcимальная длина зависит от качества исходной ДНК. Поэтому для лучшего результата рекомендуется использовать ДНК со средней длиной фрагментов не менее 30 гигабаз. Для выделения высокомолекулярной геномной ДНК можно использовать набор Blood & Cell Culture DNA Mini Kit (Qiagen).

Рекомендуемое исходное количество ДНК — не менее 400 нг. Возможно получение библиотеки из меньшего количества ДНК, а также из фрагментированной ДНК, но производительность будет ниже. Для получения библиотеки из меньших количеств ДНК рекомендуется набор PCR Sequencing Kit и протоколы Low Input и Rapid Low Input.

Так как при получении библиотеки отсутствует стадия ПЦР, данный набор пригоден для выявления модифицированных нуклеотидов.

Дополнительные расходные материалы:

• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (R0581).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227) или аналогичный.

Мультиплексное секвенирование с баркодированием удобно, если количество сиквенсных данных, получаемое с одного образца, существенно меньше производительности проточной ячейки. В таком случае имеет смысл объединять образцы в одну библиотеку и секвенировать их одновременно. Это также снижает стоимость секвенирования каждого образца.

Набор PCR Barcoding Kit удобен в тех случаях, когда:

• возможно объединение до 12 образцов в общую библиотеку с целью снижения стоимости запуска секвенатора;
• исходное количество ДНК невелико;
• предполагается оптимизировать эксперимент с целью макисмального выхода;
• требуется контроль длины рида;
• секвенируется кДНК или специфические ампликоны.

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 60 минут (без учёта стадии ПЦР)
требуемое количество ДНК	менее 100 нг двухцепочечной ДНК
необходимость ПЦР	да
фрагментация ДНК	опциональная
длина рида	равна длине ампликонов
производительность	2 гигабазы и более за 6 часов, 8 гигабаз и более за 48 часов
совместимые протоколы	PCR Barcoding Nested PCR Sequencing cDNA PCR Barcoding *
количество библиотек	6 библиотек до 12 образцов в каждой

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор PCR Barcoding Kit также может быть использован в сочетании с набором PCR cDNA Sequencing Kit (SQK-PCS109) для мультиплексного секвенирования кДНК.

Пробоподготовка заключается в опциональной фрагментации геномной ДНК с последующей достройкой концов, лигировании адаптеров к достроенным концам и ПЦР с праймерами, содержащими бар-коды. В состав набора входит 12 пар бар-кодированных праймеров. В конечном итоге образцы после ПЦР объединяются, и к смеси добавляются сиквенсные адаптеры.

Длины фрагментов, получаемых в ходе ПЦР, зависят от длины исходной матрицы и от процессивности ДНК-полимеразы. Максимальная длина рида составляет в среднем около 2 тыс п.н.

Пользователь также может использовать метод ПЦР с 2 парами праймеров (nested PCR); при этом одна пара праймеров - пользовательские праймеры к определённой последовательности ДНК, а вторая - бар-кодированные праймеры из набора. 5’-концы пользовательских праймеров должны быть комплементарны 3’-концам бар-кодированных праймеров.

Последовательности бар-кодов автоматически распознаются программой для интерпретации данных секвенирования, и риды группируются в соответствии с бар-кодами.

Ещё одно преимущество набора — если исходная ДНК загрязнена, то в ходе ПЦР существенно снижается концентрация примесей, которые могут ингибировать процесс получения библиотеки.

Если количество исходной ДНК менее 1 нг — рекомендуется предварительная полногеномная амплификация.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• набор для лигирования ДНК NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367);
• мастер-микс для ПЦР длинных фрагментов, например, LongAmp Taq 2X Master Mix (New England Biolabs M0287);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70% этанол;
• буфер 10 мМ Трис-HCl с 50 мМ NaCl.

Опционально:

• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf #5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo FS A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).

Direct cDNA Sequencing Kit — набор для прямого секвенирования кДНК. Набор предназначен для секвенирования РНК через стадию синтеза кДНК без стадии ПЦР. С помощью набора Direct DNA Sequencing Kit можно:

• идентифицировать полноразмерные транскрипты и анализировать их количество;
• исследовать дифференциальную экспрессию генов;
• характеризовать транскрипционные изоформы, варианты с альтернативным спласингом и фьюжн-транскрипты;
• секвенировать полноразмерные кДНК без артефактов, вносимых на стадии ПЦР.

В состав набора входит Pro Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотек в ячейку, совместимый с ячейками для PromethION

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 270 минут
требуемое количество ДНК	100 нг полиА + РНК
необходимость обратной транскрипции	да
необходимость ПЦР	нет
длина рида	равна длине полных транскриптов
производительность	до 2 гигабаз за 6 часов, до 8 гигабаз и более за 48 часов
число ридов	5-10 миллионов полноразмерных кДНК
мультиплексирование	до 12 образцов, с Native Barcoding Expansion Pack 1-12 или 13-24
совместимые протоколы	Direct cDNA sequencing
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-PRO002 (PromethION)

Набор рассчитан на работу с поли-А+ РНК, но возможно также использование РНК со специфическими 3’-концевыми последовательностями (например, вирусной РНК). Для этого необходимы олигонуклеотиды, комплементарные этим последовательностям. Пробоподготовка заключается в синтезе комплементарной цепи кДНК с помощью обратной транскрипции. Обогащение библиотеки полноразмерными копиями происходит за счёт переключения цепей при обратной транскрипции (strand-switching). Затем цепь РНК расщепляется, и достраивается вторая цепь кДНК. Сиквенсные адаптеры лигируются на двухцепочечную кДНК (в нанопоры может проходить любая из цепей кДНК).

При работе с Direct cDNA Sequencing Kit предусмотрена возможность мультиплексирования с помощью наборов Native Barcoding Expansion 1-12 (EXP-NBD104) или Native Barcoding Expansion 13-24 (EXP-NBD105). В одну библиотеку может быть загружено до 12 образцов кДНК.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• набор для лигирования NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70 % этанол;
• 10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0191);
• обратная транскриптаза Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific EP0751);
• ингибитор РНКаз RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific 10777019);
• смесь РНКаз RNAse Cocktail Enzyme Mix (Thermo Fisher Scientific AM2286).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS);
• охлаждающий штатив для пробирок на 0,2 мл (например, Eppendorf 3881000031).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).
  

Набор предназначен для прямого секвенирования РНК без стадии обратной транскрипции. С помощью набора Direct RNA Sequencing Kit можно:

• изучать модифицированные нуклеотиды и другие характеристики нативной РНК;
• секвенировать молекулы РНК, которые плохо подвергаются обратной транскрипции.

Особенности набора

время пробоподготовки	от 115 минут
требуемое количество ДНК	500 нг поли-А+ РНК
необходимость ПЦР	нет
обратная транскрипция	опциональная
длина рида	зависит от длины исходных фрагментов
производительность	до 1 гигабазы за 6 часов, 1-4 гигабазы за 48 часов
совместимые протоколы	Direct RNA Sequencing; Sequence-specific direct RNA sequencing*
мультиплексирование	на стадии разработки
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-MIN107

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор предназначен для работы с молекулами РНК, обладающими 3’-концевыми полиА –структурами — эукариотическими мРНК, полиаденилированными вирусными РНК или РНК, обработанными наборами для полиаденилирования. Для РНК без полиА-концов можно синтезировать пользовательские адаптеры, комплементарные 3’-концам (например, для тРНК или 16S-РНК).

В отличие от протоколов секвенирования кДНК, в случае использования набора Direct RNA Sequencing Kit происходит секвенирование нативных молекул РНК; только они проходят через поры проточной ячейки.

Стадия обратной транскрипции при пробоподготовке опциональна, но настоятельно рекомендуется — это повышает производительность секвенирования.

Набор Direct RNA Sequencing Kit незаменим в случае анализа модифицированных нуклеотидов. Если задача выявления таких нуклеотидов не ставится, рекомендуются наборы для секвенирования кДНК, так как они обеспечивают более высокую производительность.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS);
• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227).

Опционально:

• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).

Набор предназначен для секвенирования бактериальных генов, кодирующих рибосомальную РНК 16S, являющуюся видоспецифичной. С помощью набора 16S Barcoding Kit можно:

• идентифицировать видовую принадлежность бактерий;
• объединять несколько образцов в одну библиотеку

Объединение нескольких образцов, или мультиплексирование, возможно благодаря баркодированию разных ДНК. Это удобно в тех случаях, когда требуемый выход данных при секвенировании одного образца намного меньше максимального выхода, получаемого с одной проточной ячейки. В состав набора входит 12 бар-кодов, таким образом, в одну библиотеку можно загрузить до 12 образцов ДНК. Это позволяет снизить стоимость секвенирования одного образца почти в 10 раз.

Особенности набора:

время пробоподготовки	10 минут + время, необходимое для ПЦР
требуемое количество ДНК	не более 10 нг геномной ДНК
необходимость ПЦР	да
фрагментация ДНК	не требуется
длина рида	около 1500 нуклеотидов (полноразмерный ген 16S)
производительность	1-2 гигабазы за 6 часов, 4-8 гигабаз за 48 часов
совместимые протоколы	16S Barcoding*
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	R9.4.1; R10

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Пробоподготовка заключается в амплификации гена 16S со специфических праймеров (27F и 1492R), содержащих бар-коды. Затем к 5’-концам ампликонов лигируются сиквенсные адаптеры.

Анализ результатов секвенирования библиотеки, полученной с помощью 16S Barcoding Kit, проводится на платформе EPI2ME с помощью специального ПО, сортирующего риды в соответствии с баркодированием и идентифицирующего их видовую принадлежность.

В состав 16S Barcoding Kit также входит набор Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотеки в поточную ячейку.

Условия хранения: - 20 °С.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Thermo FS AB0620);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo FS R0581);
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2X (New England Biolabs M0287);
• свежеприготовленный 70% этанол;
• буферный раствор Tрис-HCl 10 мМ рН 8.0 с 50 мМ NaCl.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор;
• набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit (Thermo FS Q33227) или аналогичный;
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).

Набор предназначен для получения библиотеки из геномной ДНК в полевых условиях, когда ограничена возможность хранения реагентов при низких температурах. Процесс пробоподготовки основан на транспозазном расщеплении ДНК с последующей пришивкой сиквенсных адаптеров и занимает не более 10 минут.

Особенности набора:

время пробоподготовки	10 минут
требуемое количество ДНК	400 нг высокомолекулярной геномной ДНК
необходимость ПЦР	нет
фрагментация ДНК	транспозазная
длина рида	случайная, зависит от длины исходных фрагментов
производительность	1-2 гигабазы за 6 часов, 4-8 гигабаз за 48 часов
совместимые протоколы	Field Sequencing;
количество библиотек	6
условия хранения	до 1 месяца при температуре до +30 °С; до 3 месяцев при +4-8 °С

Набор оптимизирован для хранения при температуре окружающей среды, так как реагенты в его составе находятся в лиофилизированном виде.

Количество стадий пипетирования и время подготовки минимальны, поэтому набор даёт возможность получения длинных ридов, но максимальная длина зависит от качества исходной ДНК.

Рекомендуемое исходное количество ДНК — не менее 400 нг. Возможно получение библиотеки из меньшего количества ДНК, а также из фрагментированной ДНК, но производительность будет ниже.

Так как при получении библиотеки отсутствует стадия ПЦР, данный набор пригоден для выявления модифицированных нуклеотидов.

В состав Field Sequencing Kit также входит набор Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотеки в поточную ячейку.

Дополнительные расходные материалы:

• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (R0581).

Дополнительное оборудование:

• термостат или любое устройство с нагревом до +80 °С;
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0.5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам.

Набор предназначен для секвенирования двухцепочечной ДНК. Это наиболее универсальный набор из всех, предлагаемых Oxford Nanopore Technologies. С помощью набора Ligation Sequencing Kit можно:

• получить максимальную производительность секвенирования;
• контролировать длину секвенируемых фрагментов.

Для данного набора предлагается множество протоколов пробоподготовки библиотек из различного исходного материала (геномная ДНК, плазмидная ДНК, ампликоны) и для различных задач (геномное секвенирование de novo, ресеквенирование, таргетное секвенирование, мультиплексное секвенирование и т.д.). Процесс пробоподготовки заключается в достройке концов ДНК, пришивке 3’-концевой dA и лигировании к ней адаптеров.

Особенности набора

время пробоподготовки	60 минут
требуемое количество ДНК	1000 нг двухцепочечной ДНК
необходимость ПЦР	нет
фрагментация ДНК	опциональная, рекомендуется при количестве исходной ДНК менее 500 нг
длина рида	зависит от длины исходных фрагментов
производительность	2 гигабазы и более за 6 часов, 8 гигабаз и более за 48 часов
совместимые протоколы	Ligation Sequencing; Premium whole genome amplification; Sequence capture *
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-MIN107

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Набор оптимизирован для высокопроизводительного секвенирования. Для максимальной производительности рекомендуется получать библиотеку из 100-200 фмоль высокомолекулярной ДНК. Также важна степень чистоты ДНК, загрязнения существенно снижают производительность. Рекомендуется использовать наноспектрофотометр для оценки степени чистоты ДНК по следующим критериям:

• A260/A280 = 1,8;
• А260/А230 = 2 - 2,2.

Можно секвенировать библиотеки, полученные с помощью Ligation Sequencing Kit из меньшего количества ДНК или ДНК низкого качества, но это существенно уменьшает производительность секвенирования. Частично можно улучшить библиотеку с помощью стадии ПЦР: происходит обогащение библиотеки при малом стартовом количестве ДНК, а также снижается влияние примесей за счёт разведения образца. Но, если ПЦР является неотъемлемой частью пробоподготовки, рекомендуется использовать PCR Sequencing Kit или Rapid PCR Barcoding Kit.

Аналогично, если планируется регулярно секвенировать ампликоны или кДНК, рекомендуется использовать соответствующие наборы — PCR Sequencing Kit или, для секвенирования кДНК, cDNA-PCR Sequencing Kit и Direct cDNA Sequencing Kit.

Набор Ligation Sequencing Kit может быть использован для мультиплексного секвенирования. Для этого необходимы дополнительные наборы Native Barcoding Expansion 1-12 и 13-24 (для мультиплексирования без стадии ПЦР) или PCR Barcoding Expansion 1-12 и 1-96 (для мультиплексирования со стадией ПЦР).

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• ДНК-лигаза NEBNext Quick Ligation Module (New England Biolabs E6056);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 0030108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70% этанол.

Опционально:

• набор для репарации ДНК NEBNext FFPE Repair Mix (New England Biolabs M6630);
• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C);
• система для препаративного электрофореза BluePippin.

Набор предназначен для получения сиквенсной библиотеки из геномной ДНК в тех случаях, когда количество стартового материала ограничено. С помощью набора PCR Sequencing Kit можно:

• работать с небольшим исходным количеством ДНК;
• контролировать длину секвенируемых фрагментов;
• оптимизировать эксперимент для максимальной производительности;
• проводить таргетное секвенирование.

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 60 минут + ПЦР
требуемое количество ДНК	до 100 нг геномной ДНК
необходимость ПЦР	да
фрагментация ДНК	опциональная
длина рида	зависит от длины ампликона
производительность	3 гигабазы и более за 6 часов, 8 гигабаз и более за 48 часов
совместимые протоколы	PCR Sequencing
	Four Primer (Nested) PCR Sequencing*
мультиплексирование	до 12 образцов, с PCR Barcoding Kit
количество библиотек	6

* Полные протоколы доступны на сайте www.nanoporetech.com для зарегистрированных пользователей-участников Nanopore Community.

Пробоподготовка заключается в опциональной фрагментации ДНК с последующей достройкой концов до тупых и присоединением 3’-dA. К 3’-dA лигируются олигонуклеотиды, содержащие сайты связывания ПЦР-праймеров. ДНК амплифицируется, и к ампликонам присоединяются сиквенсные адаптеры.

Стадия ПЦР зависит от исходного количества ДНК и желаемой длины ампликонов. Рекомендуемый протокол ПЦР рассчитан на 100 нг исходной ДНК.

Длина рида составляет в среднем около 2 килобаз и зависит не столько от процессивности Taq-полимеразы, сколько от особенностей пробоподготовки. Но при этом максимальная длина рида выше, чем при использовании набора Rapid PCR Barcoding Kit и может достигать 10 килобаз.

Пользователь также может использовать метод ПЦР с 2 парами праймеров (nested PCR); при этом одна пара праймеров — пользовательские праймеры к определённой последовательности ДНК, а вторая — бар-кодированные праймеры из набора. 5’-концы пользовательских праймеров должны быть комплементарны 3’-концам бар-кодированных праймеров.

Набор позволяет работать с ДНК, содержащей примеси, которые снижают эффективность получения библиотеки. Это происходит благодаря стадии ПЦР. Но необходимо учитывать, что амплификация разных фрагментов может идти с разной эффективностью.

Если исходное количество ДНК менее 1 пг, рекомендуется полногеномная амплификация.

В состав PCR Sequencing Kit также входит набор Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотеки в поточную ячейку.

Условия хранения: -20 °С.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• набор для достройки концов ДНК NEBNext End repair / dA-tailing Module (New England Biolabs E7546);
• ДНК-лигаза NEB Blunt/TA Ligase Master Mix (New England Biolabs M0367);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Thermo FS AB0620);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo FS R0581);
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2X (New England Biolabs M0287);
• свежеприготовленный 70% этанол;
• буферный раствор Tрис-HCl 10 мМ рН 8.0 с 50 мМ NaCl.

Опционально:

• экзонуклеаза I (New England Biolabs M0293);
• пробирки для фрагментации ДНК Covaris g-TUBE.

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор;
• набор автоматических пипеток переменного объёма — от 0,5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• таймер (например, TR118OS).

Опционально:

• флуориметр Qubit (Thermo FS Q33227) или аналогичный;
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).

Набор для секвенирования кДНК со стадией ПЦР PCR-cDNA Sequencing Kit предназначен для секвенирования РНК через стадию синтеза кДНК с последующей ПЦР. С помощью набора PCR-cDNA Sequencing Kit можно:

• работать с ограниченным количеством стартового материала;
• оптимизировать ход эксперимента для получения максимальной производительности;
• исследовать дифференциальную экспрессию генов;
• характеризовать транскрипционные изоформы, варианты с альтернативным спласингом и фьюжн-транскрипты;
• секвенировать полноразмерные кДНК и анализировать их количество.

В состав набора входит Pro Flow Cell Priming Kit для загрузки библиотек в ячейку, совместимый с ячейками для PromethION

Особенности набора:

время пробоподготовки	от 165 минут
требуемое количество ДНК	1 нг полиА + РНК или 50 нг суммарной РНК
необходимость обратной транскрипции	да
необходимость ПЦР	да
длина рида	равна длине полных транскриптов
производительность	3 гигабазы и более за 6 часов, до 8 гигабаз и более за 48 часов
число ридов	7-12 миллионов и более полноразмерных кДНК
мультиплексирование	с PCR Barcoding Expansion Pack (SQK-PBK004)
совместимые протоколы	cDNA-PCR sequencing
количество библиотек	6
совместимость с проточными ячейками	FLO-MIN106D; FLO-PRO002 (PromethION)

Набор рассчитан на работу с минимальным количеством поли-А+ РНК, для получения библиотеки достаточно всего 1 нг. В случае невозможности выделения полиА+-фракции допустимо использование суммарной РНК (рекомендуется не менее 50 нг), но в этом случае требуется оптимизация пробоподготовки.

Пробоподготовка заключается в синтезе комплементарной цепи кДНК с помощью обратной транскрипции. Обогащение библиотеки полноразмерными копиями происходит за счёт переключения цепей при обратной транскрипции (strand-switching). Затем происходит синтез двухцепочечной кДНК с помощью ПЦР, в реакции используются специфические праймеры для последующего безлигазного присоединения сиквенсных адаптеров.
При работе с PCR-cDNA Sequencing Kit предусмотрена возможность мультиплексирования с помощью набора PCR Barcoding Expansion (SQK-PBK004). В одну библиотеку может быть загружено до 12 образцов кДНК.

Дополнительные расходные материалы и реактивы:

• магнитные частицы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter);
• мастер-микс для ПЦР LongAmp Taq 2x (New England Biolabs M0287);
• 1,5 мл пробирки типа Эппендорф с низкой адгезивностью DNA LoBind (Eppendorf 30108051);
• 0,2 мл тонкостенные пробирки для ПЦР (Axygen PCR-02-C);
• вода, не содержащая нуклеаз (Thermo Fisher Scientific R0581);
• свежеприготовленный 70% этанол;
• 10 мМ раствор dNTP (Thermo Fisher Scientific R0191);
• обратная транскриптаза Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific EP0751);
• ингибитор РНКаз RNAseOUT (Thermo Fisher Scientific 10777019).

Дополнительное оборудование:

• настольная микроцентрифуга (например, Eppendorf 5452000018);
• вортекс (например, Biosan BS-010203-AAG);
• магнитный штатив (Стар-лаб 3336);
• ротационный перемешиватель (например, Elmi RM1L);
• амплификатор (например, Thermo Fisher Scientific A37834);
• набор автоматических пипеток переменного объёма - от 0.5 до 10 мкл (например, Eppendorf 3120000020), от 2 до 20 мкл (например, Eppendorf 3120000038), от 10 до 100 мкл (например, Eppendorf 3120000046), от 20 до 200 мкл (например, Eppendorf 3120000054) и от 100 до 1000 мкл (например, Eppendorf 3120000062);
• наконечники с фильтром к автоматическим пипеткам;
• термоконтейнер со льдом;
• таймер (например, TR118OS);
• охлаждающий штатив для пробирок на 0,2 мл (например, Eppendorf 3881000031).

Опционально:

• флуориметр Qubit 4.0 (Thermo Q33227);
• система для фрагментного анализа (например, Qsep 100);
• наноспектрофотометр (например, NanoDrop 2000C).