Обратная транскрипция Выбраны параметры: Диаэм

Набор реактивов для обратной транкрипции с MMLV–RH представляет собой полную систему для эффективного синтеза первой цепи кДНК с использованием в качестве матрицы мРНК или суммарной РНК. Набор содержит все необходимые компоненты для проведения обратной транскрипции: обратную транскриптазу MMLV–RH, два варианта 5× ОТ-буфера, смесь dNTP, раствор ДТТ, растворы олиго(dT)₁₆ праймера и случайного гексапраймера, а также свободную от РНКаз воду.

MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.

Кроме обратной транскриптазы, набор содержит два типа буфера на основе KCl и (NH₄)₂SO₄, оптимизированные для проведения эффективной реакции обратной транскрипции с любых матриц РНК, в том числе содержащих участки повышенной сложности (сильно структурированные или GC-богатые).

Олиго(dT)₁₆ праймер и случайный гексапраймер позволяют более узконаправленно подходить к обратной транскрипции интересующих типов или участков РНК. Случайный гексапраймер неспецифически связывается с РНК-матрицей и используется для синтеза кДНК со всех типов РНК в составе суммарной РНК. Олиго(dT)₁₆ праймер селективно отжигается на полиадениновых последовательностях РНК, обеспечивая синтез кДНК только с мРНК, содержащих поли(А)-3’-конец. Также можно использовать специфичные праймеры для синтеза определённой последовательности.

Состав набора

Компонент	Кат. #
	1967.0050	1959.0250
MMLV-RH ревертаза, 100 ед. акт./ мкл*	1 × 50 мкл (5000 ед.акт.)	2 × 250 мкл (25000 ед.акт.)
5× ОТ-буфер (KCl)	1 × 220 мкл	3 × 400 мкл
5× ОТ-буфер ((NH4)2SO4)	1 × 220 мкл	3 × 400 мкл
20× смесь dNTP (10 мМ каждого)	1 × 120 мкл	2 × 300 мкл
Дитиотреитол	1 × 110 мкл	2 × 260 мкл
Случайный гексапраймер, 20 мкМ	1 × 50 мкл	1 × 260 мкл
Олиго(dT) праймер, 20 мкМ	1 × 50 мкл	1 × 260 мкл
Вода, обработанная ДЭПК	3 × 600 мкл	5 × 1.8 мл

* За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при +37 °С.

1967_Набор реактивов для обратной транскрипции с MMLV, инструкция, Стар-лаб, русск., стр. 3

Экстра-микс RT-qPCR SYBR Blue предназначен для проведения обратной транскрипции и количественной ПЦР в режиме реального времени одношаговым методом с использованием флуоресцентного красителя SYBR Green I. Кроме собственно экстра-микса RT-qPCR, в состав набора входят 2-кратный буфер RT-qPCR SYBR Blue и вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Буфер оптимизирован для протекания как обратной транскрипции, так и ПЦР (в том числе на сложных и GC-богатых матрицах) и содержит все необходимые компоненты (за исключением РНК-матрицы и праймеров), а также интеркалирующий краситель SYBR Green I. Хранение буфера при комнатной температуре в течение 2 дней не снижает эффективность реакции. Инертный краситель в составе Экстра-микса окрашивает его в голубой цвет (максимум поглощения – 615 нм) и облегчает контроль за раскапыванием смеси при использовании многолуночных планшетов.

Экстра-микс RT-qPCR представляет собой смесь обратной транскриптазы MMLV-RH и HS-Taq ДНК-полимеразы с "горячим" стартом в оптимальном соотношении для протекания обеих реакций.

MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.

HS-Taq ДНК-полимераза представляет собой рекомбинантную Taq ДНК-полимеразу, инактивированную специфическими моноклональными антителами. HS-Taq ДНК-полимераза неактивна при температуре ниже +70^оС. Для её активации необходим прогрев реакционной смеси при +95°С в течение 5 мин. Рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза обладает 5´-3´ ДНК-зависимой полимеразной активностью и 5’-3’ экзонуклеазной активностью нативной Taq ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus. Скорость продвижения Taq ДНК-полимеразы зависит от сложности ДНК-матрицы и составляет примерно 1 т.п.н./мин. Рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза идеально подходит для стандартной ПЦР с матрицы до 5 т.п.н.; обладает способностью присоединять аденин к 3’-концу синтезируемой цепи, поэтому продукты ПЦР могут использоваться для ТА-клонирования.

SYBR Green I - флуоресцентный интеркалирующий краситель для количественной и качественной детекции продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени. SYBR Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов (в том числе в режиме реального времени). В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР-продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал. Максимумы поглощения и испускания SYBR Green I - 494 нм и 521 нм соответственно, что позволяет использовать его со всеми известными на сегодняшний день амплификаторами для проведения ПЦР в режиме реального времени.

Состав набора

Кат. №	Кол-во реакций по 50 мкл	Экстра-микс RT-qPCR	Буфер RT-qPCR SYBR Blue(2x)	ДМСО	Вода, обработанная ДЭПК
1969.0040	40	80 мкл	2 х 0,5 мл	0,5 мл	2 х 0,5 мл
1969.0200	200	2 х 200 мкл	4 х 1,25 мл	0,5 мл	3 х 1,8 мл

Состав Экстра-микса RT-qPCR:

• 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);
• 100 мM NaCl;
• MMLV-RH обратная транскриптаза;
• HS-Taq ДНК-полимераза;
• 1 мМ ЭДТА;
• 5 мМ дитиотреитол;
• 50% (v/v) глицерин;
• 0,1% (v/v) NP-40.

Состав буфера RT-qPCR SYBR Blue (2х):

• 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);
• 150 мM КCl;
• 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
• 10 мМ MgCl₂;
• 8 мМ дитиотреитол;
• интеркалирующий краситель SYBR Green I;
• инертный краситель;
• стабилизаторы и усилители активности ферментов.

Преимущества использования экстра-микса:

• Высокая специфичность.
• Высокая чувствительность.
• Простота и удобство в использовании.
• Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.
• Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).
• Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов.

Область применения:

• Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.
• Количественный анализ РНК, в том числе анализ экспрессии генов.

Ограничения к использованию:

• Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 тыс. п.н.
• Не рекомендуется использовать для ПЦР с флуоресцентными зондами.

Срок хранения и транспортировка:
9 месяцев при -20 °С; не более 30 циклов замораживания- азмораживания экстра-микса RT-qPCR.

Экстра-микс RT-PCR Color предназначен для проведения обратной транскрипции и ПЦР одношаговым методом. Кроме собственно экстра-микса, в состав набора входят 2-кратный буфер RT-PCR Color, ДМСО и вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Буфер оптимизирован для протекания как обратной транскрипции, так и ПЦР и содержит все необходимые компоненты (за исключением РНК-матрицы и праймеров). Хранение буфера при комнатной температуре в течение 2 дней не снижает эффективность реакции. Буфер содержит красители, не влияющие на работу ферментов, и компоненты, увеличивающие плотность пробы для удобства нанесения на гель.

Экстра-микс RT-PCR Color представляет собой смесь обратной транскриптазы MMLV-RH и HS-Taq ДНК-полимеразы с "горячим" стартом в оптимальном соотношении для протекания обеих реакций.

MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.

HS-Taq ДНК-полимераза представляет собой рекомбинантную Taq ДНК-полимеразу, инактивированную специфическими моноклональными антителами. HS-Taq ДНК-полимераза неактивна при температуре ниже +70^оС. Для её активации необходим прогрев реакционной смеси при +95°С в течение 5 мин. Рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза обладает 5´-3´ ДНК-зависимой полимеразной активностью и 5’-3’ экзонуклеазной активностью нативной Taq ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus. Скорость продвижения Taq ДНК-полимеразы зависит от сложности ДНК-матрицы и составляет примерно 1 т.п.н./мин. Рекомбинантная HS-Taq ДНК-полимераза идеально подходит для стандартной ПЦР с матрицы до 5 т.п.н.; обладает способностью присоединять аденин к 3’-концу синтезируемой цепи, поэтому продукты ПЦР могут использоваться для ТА-клонирования.

Состав набора

Кат. №	Кол-во реакций по 50 мкл	Экстра-микс RT-PCR Color	Буфер RT-PCR Color (2x)	ДМСО	Вода, обработанная ДЭПК
1971.0040	40	80 мкл	2 х 0,5 мл	0,5 мл	2 х 0,5 мл
1971.0200	200	2 х 200 мкл	4 х 1,25 мл	0,5 мл	3 х 1,8 мл

Состав Экстра-микса RT-qPCR:

• 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);
• 100 мM NaCl;
• MMLV-RH обратная транскриптаза;
• HS-Taq ДНК-полимераза;
• 1 мМ ЭДТА;
• 5 мМ дитиотреитол;
• 50% (v/v) глицерин;
• 0,1% (v/v) NP-40.

Состав буфера RT-qPCR (2х):

• 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);
• 150 мM КCl;
• 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
• 6 мМ MgCl₂;
• 8 мМ дитиотреитол;
• стабилизаторы и усилители активности ферментов;
• маркерные красители.

Преимущества использования экстра-микса:

• Высокая специфичность.
• Высокая чувствительность.
• Простота и удобство в использовании.
• Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.
• Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).
• Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов.
• Сокращается стадия пробоподготовки для анализа результатов ПЦР - благодаря утяжеляющим добавкам и красителям, не требуется буфер для нанесения пробы на гель.

Область применения:

• Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.
• Анализ экспрессии генов.

Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 тыс. п.н.

Срок хранения и транспортировка:
9 месяцев при -20 °С; не более 30 циклов замораживания-размораживания экстра-микса RT-qPCR.

1971_Экстра-микс для RT-PCR Color, инструкция, Стар-лаб, русск., 5 стр.

Стерильная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК), свободная от РНКаз и ДНКаз, предназначена для работы c ДНК и РНК, приготовления растворов для молекулярно-биологических работ, проведения различных молекулярно-биологических реакций.

Условия хранения: комнатная температура.

Ингибитор РНКаз RiboBond ингибирует рибонуклеазную активность эукариотических ферментов, таких как РНКаза A, РНКаза B, РНКаза C, и защищает РНК от неспецифического гидролиза. Представляет собой рекомбинантный белок массой 50 кДа, экспрессируемый в E.coli, предназначен для использования в приложениях, где присутствие РНКаз может снизить качество результатов экспериментов, например при выделении РНК, синтезе кДНК, ОТ-ПЦР, транскрипции и трансляции in vitro.

Условия хранения: -20 °С.

Реагент RIsave для стабилизации и хранения РНК в образцах крови или костного мозга для последующего анализа предназначен для стабилизации и хранения внутриклеточной мРНК из периферической крови или костного мозга, что актуально в случаях транспортировки, либо при длительном хранении биоматериала для последующего выполнения молекулярно-генетических исследований. Реагент содержит в своем составе вещества, стабилизирующие мРНК, что обеспечивает максимально близкие по отношению к нативному биоматериалу значения экспрессии исследуемых генов.

Особенности реагента RIsave

Реагент RIsave имеет следующие особенности:

• стабилизирует РНК в образцах крови или костного мозга;
• незаменим при анализе экспрессии генов;
• пригоден для длительного хранения образцов без деградации РНК;
• совместим с реагентом RIzol для последующего выделения РНК;
• хранение и использование при комнатной температуре.

Рекомендации по условиям хранения и транспортировки образцов крови и костного мозга с использованием реагента для стабилизации РНК:

• комнатная температура (от 18 до 25 °С) — 3 суток;
• хранение в холодильнике (от 2 до 8 °С) — 5 суток;
• заморозка (от -20 до -70 °С) — до 8 лет.

Условия хранения: 18-25 °C.

Реагент RItisave для стабилизации РНК в разнообразных образцах тканей: головного мозга, сердца, почки, селезенки, печени, яичек, скелетной мышцы, жировой ткани, легких и тимуса, быстро проникает в ткань и стабилизирует клеточную РНК при комнатной температуре, одинаково эффективен для выделения различных типов РНК.

Особенности реагента RItisave

Реагент RItisave имеет следующие особенности:

• позволяет не проводить немедленную заморозку образца в жидком азоте или выделение РНК с последующей обратной транскрипцией;
• стабилизирует РНК в разнообразных образцах тканей;
• быстро проникает в ткань и стабилизирует клеточную РНК при комнатной температуре;
• используется для длительного хранения образцов тканей без деградации РНК.
• совместим с реагентом RIzol, реагентом TRIzol или иными коммерчески доступными наборами для последующего выделения РНК из ткани;
• перед выделением РНК достаточно просто удалить реагент, дополнительная пробоподготовка при этом не требуется;
• при изоляции взвеси клеток желательно ресуспендировать их в небольшом объеме PBS.

Реагент сохраняет РНК в тканях в течение:

• 1 день при 37 °C;
• 1 неделю при 25 °C;
• 1 месяц при 4 °C;
• до 1 года при -20 °C.

Условия хранения: 18-25 °C.

Область применения: синтез первой цепи кДНК для ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени, синтез кДНК для клонирования, получение меченых кДНК-зондов для микрочипов (microarray), мечение ДНК, анализ РНК с помощью праймер-экстеншн.

Рекомбинантная форма, выделенная из E. coli, не содержит доменa РНКазы Н Буфер хранения: 50 мМ трис-HCl, pH 8,0 (при 25°C ), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейтол, 50 % глицерин и 0,1 % NP-40. Условия определения активности: 50 мМ трис-HCl, pH 8,3 (при 25°С), 40 мМ KCl, 6 мМ KCl, 50 мM [3H] dTTP, 1 мМ дитиотрейтол, poly А 2 А260/мл, 2 мкМ d(pT)12, 100 мкг/мл БСА. Определение активности: За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при 37°С. Хранение и транспортировка: -20°С