Обратная транскрипция

MMLV–RH – генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M-MuLV). Она отличается от обратной транскриптазы MMLV дикого типа структурой, каталитическими свойствами и температурным оптимумом активности. Фермент проявляет РНК- и ДНК-зависимую полимеразную активность, но лишен активности РНКазы Н. MMLV–RH проявляет оптимальную активность при +42°С (активна до +50°С). Фермент способен синтезировать первую цепь кДНК длиной до 10 т.н. и включать модифицированные основания.

Кроме обратной транскриптазы, набор содержит два типа буфера на основе KCl и (NH₄)₂SO₄, оптимизированные для проведения эффективной реакции обратной транскрипции с любых матриц РНК, в том числе содержащих участки повышенной сложности (сильно структурированные или GC-богатые).

Олиго(dT)₁₆ праймер и случайный гексапраймер позволяют более узконаправленно подходить к обратной транскрипции интересующих типов или участков РНК. Случайный гексапраймер неспецифически связывается с РНК-матрицей и используется для синтеза кДНК со всех типов РНК в составе суммарной РНК. Олиго(dT)₁₆ праймер селективно отжигается на полиадениновых последовательностях РНК, обеспечивая синтез кДНК только с мРНК, содержащих поли(А)-3’-конец. Также можно использовать специфичные праймеры для синтеза определённой последовательности.

Состав набора

* За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль dTMP в кислотонерастворимый продукт за 10 мин при +37 °С.

• 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);
• 100 мM NaCl;
• MMLV-RH обратная транскриптаза;
• HS-Taq ДНК-полимераза;
• 1 мМ ЭДТА;
• 5 мМ дитиотреитол;
• 50% (v/v) глицерин;
• 0,1% (v/v) NP-40.

• 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);
• 150 мM КCl;
• 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
• 10 мМ MgCl₂;
• 8 мМ дитиотреитол;
• интеркалирующий краситель SYBR Green I;
• инертный краситель;
• стабилизаторы и усилители активности ферментов.

• Высокая специфичность.
• Высокая чувствительность.
• Простота и удобство в использовании.
• Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.
• Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).
• Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов.

• Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.
• Количественный анализ РНК, в том числе анализ экспрессии генов.

• Не рекомендуется использовать для ампликонов длиной свыше 5 тыс. п.н.
• Не рекомендуется использовать для ПЦР с флуоресцентными зондами.

• 50 мM Трис-НCl, рН 8.0 (при +25 °С);
• 100 мM NaCl;
• MMLV-RH обратная транскриптаза;
• HS-Taq ДНК-полимераза;
• 1 мМ ЭДТА;
• 5 мМ дитиотреитол;
• 50% (v/v) глицерин;
• 0,1% (v/v) NP-40.

• 100 мM Трис-НCl, рН 8.3 (при +25 °С);
• 150 мM КCl;
• 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата;
• 6 мМ MgCl₂;
• 8 мМ дитиотреитол;
• стабилизаторы и усилители активности ферментов;
• маркерные красители.

• Высокая специфичность.
• Высокая чувствительность.
• Простота и удобство в использовании.
• Низкая ошибка пипетирования и вероятности кросс-контаминации.
• Стандартизация условий постановки однотипных реакций (снижается погрешность при смешивании компонентов ПЦР в разных экспериментах).
• Возможность ТА-клонирования ПЦР-продуктов.
• Сокращается стадия пробоподготовки для анализа результатов ПЦР - благодаря утяжеляющим добавкам и красителям, не требуется буфер для нанесения пробы на гель.

• Одношаговая стандартная ОТ-ПЦР.
• Анализ экспрессии генов.

Деионизованная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) и отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для экспериментов с использованием РНК.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Не предназначена для ПЦР и экспериментов in vivo.

Деионизованная вода, отфильтрованная через мембрану 0.22 мкм. Предназначена для молекулярной биологии.

Не содержит экзо- и эндонуклеаз, а также фосфатаз.

Стерильная вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (ДЭПК), свободная от РНКаз и ДНКаз, предназначена для работы c ДНК и РНК, приготовления растворов для молекулярно-биологических работ, проведения различных молекулярно-биологических реакций.

Условия хранения: комнатная температура.

Ингибитор РНКаз RiboBond ингибирует рибонуклеазную активность эукариотических ферментов, таких как РНКаза A, РНКаза B, РНКаза C, и защищает РНК от неспецифического гидролиза. Представляет собой рекомбинантный белок массой 50 кДа, экспрессируемый в E.coli, предназначен для использования в приложениях, где присутствие РНКаз может снизить качество результатов экспериментов, например при выделении РНК, синтезе кДНК, ОТ-ПЦР, транскрипции и трансляции in vitro.

Условия хранения: -20 °С.

Ингибитор RiboLock ингибирует активность РНКаз А, В и С по неконкурентному механизму в соотношении 1 : 1. Не ингибирует эукариотические РНКазы T1, T2, U1, U2, CL3 и прокариотические РНКазы H и I.

Работает в большинстве реакционных смесей и защищает РНК от деградации при температурах до +55^оС.

Рекомендуемая рабочая концентрация - 1 ед/мкл.

В состав буфера для хранения входит ДТТ, который обеспечивает стабильность ингибитора, но не является необходимым компонентом реакционной смеси.

Области применения:

• Предохранение РНК от деградации при транскрипции и трансляции in vitro, обратной транскрипции, амплификации РНК, выделении мРНК-протеинового комплекса из клеток млекопитающих;
• выделение и хранение РНК;
• исследование специфической РНКазной активности.

Условия хранения: -20^оС

Набор iScript Select для синтеза длинных кДНК, Bio-Rad содержит оптимизированную смесь праймеров; простая подготовка реакции и малое время прохождения; высокая чувствительность – от 1 пг РНК; содержит все необходимые компоненты; размер синтезируемого продукта от 6 000 п.о. и более.

Набор с обратной транскриптазой RevertAid - полная система для эффективного синтеза первой цепи кДНК ан РНК-матрицах. В состав набора входит обратная рестриктаза RevertAid - рекомбинантная обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (M-MuLV-RT). Она активна при температурах от +42 до +50оС и способна синтезировать кДНК до 13 тыс. п.н.

В состав набора также входят: реакционный буфер, смесь дезокситрифосфатов, ингибитор РНКаз RiboLock, случайный 6-нуклеотидный праймер, олиго(дТ)18 праймер и контольный препарат - праймеры и матрица GAPDH.

Олиго(дТ)₁₈ праймер предназначен для специфического отжига на 3’-поли(А) матричной РНК. Для обратной транскрипции 5-концов РНК и РНК без поли(А)-концов используется случайный праймер.

Области применения:

• Синтез первой цепи кДНК в реакциях ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени;
• синтез полноразмерных библиотек кДНК;
• синтез антисмысловой РНК.

Условия хранения: -20^оС

Набор с обратной транскриптазой RevertAid - полная система для эффективного синтеза первой цепи кДНК ан РНК-матрицах. В состав набора входит обратная рестриктаза RevertAid - рекомбинантная обратная транскриптаза вируса лейкемии мышей (M-MuLV-RT). Она активна при температурах от +42 до +50оС и способна синтезировать кДНК до 13 тыс. п.н.

В состав набора также входят: реакционный буфер, смесь дезокситрифосфатов, ингибитор РНКаз RiboLock, случайный 6-нуклеотидный праймер, олиго(дТ)18 праймер и контольный препарат - праймеры и матрица GAPDH.

Олиго(дТ)18 праймер предназначен для специфического отжига на 3’-поли(А) матричной РНК. Для обратной транскрипции 5-концов РНК и РНК без поли(А)-концов используется случайный праймер.

Также возможно использование ген-специфичных праймеров. Первая цепь кДНК может быть использована как матрица в ПЦР, ПЦР в реальном времени или для синтеза второй цепи кДНК.

Условия хранения: -20^оС

Набор реагентов для лизиса клеток. Полученные с помощью набора клеточные лизаты используются для постановки реакции ОТ-ПЦР без дополнительной очистки РНК. Доля лизата в реакционной смеси при постановке обратной транскрипции может составлять до 45%, при постановке количественной ПЦР – до 20%. Количество клеток в одной реакции лизиса – от 10 до 10⁵, время лизиса – 20 минут. В состав набора входят лизирующий буфер и растворы протеиназы К и ДНКазы.

Реагент RIsave для стабилизации и хранения РНК в образцах крови или костного мозга для последующего анализа предназначен для стабилизации и хранения внутриклеточной мРНК из периферической крови или костного мозга, что актуально в случаях транспортировки, либо при длительном хранении биоматериала для последующего выполнения молекулярно-генетических исследований. Реагент содержит в своем составе вещества, стабилизирующие мРНК, что обеспечивает максимально близкие по отношению к нативному биоматериалу значения экспрессии исследуемых генов.

Особенности реагента RIsave

Реагент RIsave имеет следующие особенности:

• стабилизирует РНК в образцах крови или костного мозга;
• незаменим при анализе экспрессии генов;
• пригоден для длительного хранения образцов без деградации РНК;
• совместим с реагентом RIzol для последующего выделения РНК;
• хранение и использование при комнатной температуре.

Рекомендации по условиям хранения и транспортировки образцов крови и костного мозга с использованием реагента для стабилизации РНК:

• комнатная температура (от 18 до 25 °С) — 3 суток;
• хранение в холодильнике (от 2 до 8 °С) — 5 суток;
• заморозка (от -20 до -70 °С) — до 8 лет.

Условия хранения: 18-25 °C.

Реагент RItisave для стабилизации РНК в разнообразных образцах тканей: головного мозга, сердца, почки, селезенки, печени, яичек, скелетной мышцы, жировой ткани, легких и тимуса, быстро проникает в ткань и стабилизирует клеточную РНК при комнатной температуре, одинаково эффективен для выделения различных типов РНК.

Особенности реагента RItisave

Реагент RItisave имеет следующие особенности:

• позволяет не проводить немедленную заморозку образца в жидком азоте или выделение РНК с последующей обратной транскрипцией;
• стабилизирует РНК в разнообразных образцах тканей;
• быстро проникает в ткань и стабилизирует клеточную РНК при комнатной температуре;
• используется для длительного хранения образцов тканей без деградации РНК.
• совместим с реагентом RIzol, реагентом TRIzol или иными коммерчески доступными наборами для последующего выделения РНК из ткани;
• перед выделением РНК достаточно просто удалить реагент, дополнительная пробоподготовка при этом не требуется;
• при изоляции взвеси клеток желательно ресуспендировать их в небольшом объеме PBS.

Реагент сохраняет РНК в тканях в течение:

• 1 день при 37 °C;
• 1 неделю при 25 °C;
• 1 месяц при 4 °C;
• до 1 года при -20 °C.

Условия хранения: 18-25 °C.

Особенности реагента RNAlater

• не требует заморозки тканей перед консервацией;
• сохраняет количественный и качественный состав РНК;
• сохраняет РНК 1 сутки при температуре 37°C, 1 неделю при комнатной температуре, 1 месяц при 4°C, либо любой срок при -20°C;
• совместим с любыми процедурами выделения РНК;
• тестирован на широком спектре тканей различных организмов;
• заполняет полости и органы многоклеточных организмов для инактивации РНКаз и стабилизации РНК по всему объёму ткани;
• требуется небольшой объём реагента для стабилизации РНК в образце;
• позволяет собирать образцы тканей в местах, где немедленная изоляция РНК невозможна;
• для последующего выделения РНК из образца не требуется отмывать реагент.

Супермикс iScript RT Supermix, 25 rxns х 20 µl – готовая 5-кратная смесь для синтеза первой цепи кДНК. Содержит обратную транскриптазу MMLV-H⁺, ингибитор РНКаз, дезокситрифосфаты, смесь олиго-dT и случайного праймеров, MgCl₂ и стабилизирующие добавки.

Особенности обратной транскриптазы RevertAid

• cинтезирует первую цепь кДНК до 13 тыс п.н.;
• оптимальная температура реакции +42 °С;
• активна до +50 °С;
• способна встраивать модифицированные нуклеотиды — меченые Су3, Су5, родамином родамином или флюоресцеином.
  

Области применения обратной транскриптазы RevertAid

• синтез первой цепи кДНК в реакциях ОТ-ПЦР или ОТ-ПЦР в реальном времени;
• синтез кДНК для клонирования или экспрессии белков;
• мечение ДНК для микрочипов;
• анализ РНК с помощью праймер-экстеншн.

Основные характеристики обратной транскриптазы Maxima H minus

• термостабильность — температурный оптимум составляет от +50 до +60 °С, фермент сохраняет активность до 65 °С;
• отсутствие РНКазной активности позволяет синтезировать кДНК до 20 тыс. п.н.;
• высокая чувствительность и воспроизводимость — стартовое количество РНК может варьировать от 1 пг до 5 мкг;
• высокая эффективность — синтез полноразмерных кДНК занимает 15-30 минут;
• 50-кратная процессивность (по сравнению с ревертазой MMLV) обеспечивает устойчивость к ингибиторам-гуанидину, формамиду, этанолу;
• способна встраивать модифицированные нуклеотиды.