Пиросеквенаторы

Пиросеквенатор — прибор определяющий первичную последовательность ДНК методом пиросеквенирования. Пиросеквенирование — метод «секвенирования синтезом новой цепи» основанный на регистрации акта присоединения нуклеотида по образующемуся пирофосфату. Последовательность подачи в реакционную смесь реагентов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность анализируемого участка ДНК.

Пробоподготовка и принцип процесса пиросеквенирования Стадия 1 (пробоподготовка) Амплификация целевого фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для пиросеквенирования. Инкубация ампликона с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином. Денатурация и отмывка биотинилированного одноцепочечного ампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования в области анализируемого локуса. Стадия 2 Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и люциферина. Стадия 3 Добавление первого дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК–полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов. Стадия 4 АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’-фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу. Стадия 5 В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме.

Схема процесса пиросеквенирования

Достоинства метода: высокая скорость анализа (15-30 минут); сочетание секвенирования и количественного анализа (G-C соотношение); количественная оценка аллелей, в том числе редко встречаемых; обнаружение неизвестных вариаций нуклеотидных последовательностей; возможность разностороннего исследования образцов при единичном запуске прибора; встроенные контроли исследования, гарантирующие точность и достоверность результатов.

Недостатки метода: трудности с детекцией гомополимерных участков большой протяженности; небольшая длина секвенируемых фрагментов (до 200 п.н.).

Области применения пиросеквенирования:

• генетическая паспортизация и выявление генетических полиморфизмов, ассоциированных с развитием мультифакториальных заболеваний; генетический анализ транслокаций, инсерций, делеций, SNPs; верификация и валидация результатов полногеномного анализа;
  
  
• онкология (выявление активирующих соматических мутаций в генах EGFR, RAS, BRAF, PI3K и др.; анализ метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: MGMT, MLH1, p16 и др.; поиск новых генетических маркеров злокачественных новообразований);
  
  
• микробиология и генная инженерия (генотипирование штаммов; ресеквенирование генов: обнаружение новых генетических вариантов, островков патогенности, вирулентности и т.д.; идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость вирусов к антиретровирусной терапии; идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость бактерий и грибов к антибиотикам; проверка результатов клонирования: секвенирование ПЦР-ампликонов, плазмид, ДНК-кассет; разработка уникальных ПЦР тест-систем).

Критерии выбора пиросеквенатора:

• производительность (от 24 до 96 образцов за запуск);
• ручная или полностью автоматизированная пробоподготовка;
• максимальная длина прочтений (учитывается в зависимости от применения).