Кариотипирование и FISH-анализ

Кариотипирование — цитогенетический метод определения кариотипа (совокупность признаков полного набора хромосом биологического вида, организма, клеточной линии).

Для определения кариотипа используются клетки в метафазе митоза (у человека используют, как правило, лимфоциты периферической крови, также могут быть использованы клетки костного мозга или первичная культура фибробластов кожи). Для увеличения числа клеток на стадии метафазы к культуре клеток в специальной среде незадолго перед фиксацией добавляют колхицин, который блокирует образование микротрубочек, тем самым препятствуя расхождению хроматид к полюсам деления клетки и завершению митоза.

После фиксации препараты метафазных хромосом окрашивают и фотографируют, используя исследовательские микроскопы с цифровыми камерами. Из микрофотографий формируют кариотип — нумерованный набор пар гомологичных хромосом. Далее производится анализ полученных изображений при помощи специализированных программных инструментов.

Для получения классического кариотипа используется окраска хромосом различными красителями или их смесями — в силу различий в связывании красителя с различными участками хромосом окрашивание происходит неравномерно и образуется характерная полосчатая структура (комплекс поперечных меток-banding), отражающая линейную неоднородность хромосомы и специфичная для гомологичных пар хромосом и их участков (за исключением полиморфных районов, локализуются различные аллельные варианты генов).

Достоинства метода: анализ структуры и количества непосредственно хромосом, выявление сбалансированных транслокаций, маркерных хромосом, мозаицизма.

Недостатки метода: невысокая разрешающая способность (10 Мб), невозможность определения микрохромосомных перестроек (делеций, дупликаций, инверсий, инсерций); качество анализа зависит от опыта исследователя и качества препаратов (морфологии хромосом, окрашивания); невозможность анализа при отсутствии делящихся клеток.

Области применения кариотипирования:

• выявление различных хромосомных аномалий (числовых и структурных);
• цитогенетический анализ животных и растений для выявления селекционной ценности, чистопородности, генетической паспортизации.

FISH-анализ (Fluorescence In Situ Hybridization) — цитогенетический метод, применяющийся для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ, а также для выявления специфических мРНК в образце ткани (установление пространственно-временных особенностей экспрессии генов в клетках и тканях).

Метод FISH-анализа использует короткие флуоресцентно-меченые последовательности ДНК (зонды), комплементарные по отношению к исследуемым последовательностям. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. Гибридизация проводится в препарате на предметном стекле с использованием специальных термостатов-гибридайзеров. Дальнейшая обработка производится путем флуоресцентной микроскопии и специального программного обеспечения.

Достоинства метода FISH-анализа: разрешающая способность — 100-300 Kб, возможность определения микрохромосомных перестроек (делеций, дупликаций, инверсий, инсерций); более объективный, относительно легкий, быстрый и хорошо воспроизводимый метод анализа; возможность проведения анализа на культурах клеток с низкой митотической активностью, фиксированных клетках и тканях (interphase FISH).

Недостаток метода: таргетный анализ (зависит от специфичности используемого ДНК-зонда).

Области применения FISH:

• преимплантационная генетическая диагностика (ПГД);
• пренатальная диагностика;
• постнатальная диагностика (уточнение/верификация результатов стандартного цитогенетического исследования; исследование сложных перестроек — тройных и более сложных транслокаций, инсерций; определение степени мозаицизма; исследование природы маркерных хромосом; исследование хромосомных перестроек в онкогематологии; диагностика солидных опухолей; скрининг анеуплоидий сперматозоидов).